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《石河子大学》 2008年
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口蹄疫病毒干扰RNA转基因小鼠模型的构建

王鹏雁  
【摘要】: 目的:口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物急性、高度传播性疾病,由于口蹄疫病毒存在7个血清型和70多个亚型,各型间不存在交叉保护作用,所以用疫苗和传统的自然育种方法很难控制此病。而且此病近年来在无口蹄疫国家的爆发给发病国和邻近国家造成巨大的经济损失。因此,研究并发展新的抗病毒方法以控制口蹄疫是非常必要的。RNA干扰(RNAi)是广泛存在于生物体内的由21-23nt小双链RNA诱导序列特异性的转录后的基因表达沉默现象,RNAi对基因表达的调控、病毒感染的防护、基因转座的控制等都具有重要的意义。RNAi从发现开始就受到病毒学研究者的高度重视,被认为是抗病毒感染最有效的方法之一。许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制的干扰研究,并取得了良好的进展。为了发展控制口蹄疫的新方法,本研究对口蹄疫病毒的体内外复制进行了RNA干扰的探索,在此基础上,构建了靶向口蹄疫病毒的siRNA的转基因小鼠模型,并对所得的转基因鼠进行抗病毒的评价。为RNAi应用于口蹄疫病毒的基因功能研究以及口蹄疫的防治积累了必要的实验数据,为动物的抗病育种提供一条新的思路。 方法:对7个血清型的FMDV基因组序列进行同源性比较后,初步筛选7个siRNA作用的靶位点。根据siRNA表达载体pSilencer 5.1–H1 Retro对插入序列的要求,设计合成了7个针对FMDV的shRNA表达序列的DNA序列。构建针对以上靶序列的siRNA表达载体。选择其中针对高保守的2B、3D区重组质粒瞬时转染BHK-21单层细胞后接种O、A、AsiaI型口蹄疫病毒检测在细胞水平上表达的siRNA对病毒复制抑制效果;将重组质粒注射乳鼠后用5 LD50和20 LD50的O型、AsiaI型FMDV感染观察小鼠死亡情况;在对细胞水平病毒繁殖有一定效果的基础上,利用显微注射法构建了靶向口蹄疫病毒2B、3D区的siRNA的转基因小鼠模型。为了检测siRNAs抗病毒的活性,我们对F1代成年鼠直接皮下接种0.5 ml 100 LD50 AsiaI FMDV口蹄疫病毒,72h后小鼠经眼眶放血处死,及时取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏制备常规病理切片,同时观察病变。用免疫组织化学染色法来评价转基因小鼠对口蹄疫病毒的抵抗作用。 结果:经酶切和序列测定,正确构建了靶向FMDV的siRNA表达载体,分别命名为:pSi-FMDV1、pSi-FMDV2、pSi-FMDV3、pSi-FMDV4、pSi-FMDV5、pSi-FMDV6、pSi-FMDV7。用大量制备的重组质粒pSi-FMD2、pSi-FMD3转染BHK-21单层细胞后接种病毒,结果发现,与对照组相比,实验组细胞出现细胞病变现象的程度要轻;不同时间段收集的细胞上清液测得的TCID50值比对照有一定程度的降低。注射重组质粒后对小鼠攻毒可使小鼠模型发病率降低,小鼠的死亡数减少。 在以上基础上将上述两个包含有整个表达框的siRNA片段经显微注射法构建了转基因小鼠模型。FMD2基因共注射506枚受精卵,移植到23只假孕母鼠输卵管内,其中17只怀孕,产仔104只。FMD3基因共注射469枚受精卵,移植到22只假孕母鼠输卵管内,其中9只怀孕,产仔55只。所有F0代小鼠经PCR检测,结果共有6只为阳性。转基因亲代小鼠与正常异性健康小鼠交配后,其后代鼠经PCR检测,有20%-30%遗传获得转基因;转基因小鼠之间进行交配后,100%的后代鼠遗传获得转基因。目前,FMD2基因传代到F3代。FMD3基因已经传至F6代,仍有20%左右转基因阳性小鼠检出。转基因小鼠外表未见任何异常。 对F1代成年鼠直接感染口蹄疫病毒,感染后的转基因小鼠取组织制备石蜡切片,与正常小鼠感染后的组织切片比较病理变化的程度;同时对切片进行免疫组织化学染色,检测转基因小鼠体内表达的siRNA对病毒复制的抑制效果。结果表明:与对照相比,转基因小鼠攻毒后各组织器官病变轻微;其中,脾脏的脾小体明显增大,显示转基因小鼠体内细胞免疫功能加强;免疫组织化学结果显示,在对照组小鼠的脾脏、肝脏和肾脏中有病毒粒子的存在。而在转基因小鼠,只在脾脏和肝脏中可见少量的阳性病毒粒子。结论:以上结果表明设计的siRNA在细胞水平上和个体水平上都对口蹄疫病毒复制有一定的抑制效果;为大家畜的抗病育种提供了一个思路。
【学位授予单位】:石河子大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S852.65

【引证文献】
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【参考文献】
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1 卢永干;1997年台湾省口蹄疫流行概况[J];中国兽医科技;1998年05期
2 郭志儒,金宁一;2001年英国口蹄疫流行回顾[J];中国兽医学报;2002年01期
【共引文献】
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1 黑淑梅;慕明涛;;DNA甲基化在植物生长发育中的作用[J];安徽农业科学;2007年21期
2 孙靖;向华;靳野;蔡建平;王贵平;尚佑军;宣华;刘湘涛;;口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定[J];安徽农业科学;2009年14期
3 崔广荣;植物转基因方法及特点和转基因沉默现象[J];安徽技术师范学院学报;2003年01期
4 杨素娟;;口蹄疫流行病学及感染机制的研究进展[J];北京农业;2007年12期
5 高飞;孙国斌;张金凤;;国外口蹄疫流行现状分析及防治策略[J];北京农学院学报;2006年01期
6 李成,张滨丽,李杰;RNAi技术的研究进展和发展前景[J];东北农业大学学报;2005年03期
7 郑强,叶尔江·苏里唐;口蹄疫的流行及其防制[J];地方病通报;1999年02期
8 赵洪波,张嘉宁;RNA干扰技术的应用[J];大连医科大学学报;2003年04期
9 曹轶梅,卢曾军,刘在新,谢庆阁;口蹄疫自然感染动物与免疫动物鉴别诊断研究进展[J];动物医学进展;2003年06期
10 邬苏晓,刘镇明,罗满林,戚一达;口蹄疫病毒3ABC基因的克隆与测序[J];动物医学进展;2004年04期
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3 潘建伟;大麦根尖和边缘细胞铝毒生物学特性及其机理研究[D];浙江大学;2002年
4 朱雪峰;水稻T-DNA整合的遗传定位与位置效应一个水稻多子房突变体的遗传分析与基因定位[D];中国农业科学院;2002年
5 陈章权;温敏核雄性不育水稻育性转换相关基因的克隆及其RNAi植物表达载体的构建[D];华南热带农业大学;2002年
6 时焦;几丁质酶基因在烟草中表达及对真菌病害的抗性研究[D];河南农业大学;2003年
7 邓凡;Wnt信号通路中AXIN1上调蛋白AXUD1的克隆表达及其功能 研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
8 赵艳;基因枪介导转化的外源基因表达框和质粒在水稻中遗传和表达行为的比较研究[D];浙江大学;2003年
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1 闰永荣;大麦醇溶蛋白RNAi植物表达载体的构建及幼胚高效再生体系的建立[D];甘肃农业大学;2010年
2 张先锋;口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC、3AB、3A的克隆表达及3A蛋白间接ELISA方法的初步建立[D];新疆农业大学;2010年
3 公娇芬;利用反向重复结构转基因及其侧翼序列转化获得双抗病毒转基因烟草[D];山东农业大学;2011年
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5 宋军;牛Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白B细胞线性抗原表位鉴定[D];东北农业大学;2011年
6 闫永荣;大麦醇溶蛋白RNAi植物表达载体的构建及幼胚高效再生体系的建立[D];甘肃农业大学;2010年
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8 谢守玉;华南地区口蹄疫流行毒株VP1基因核苷酸序列分析及FMDV衣壳蛋白前体P1在FCV中的表达[D];广西大学;2011年
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3 刘建;范慧敏;刘中民;;慢病毒介导shRNA特异性沉默TLR4基因对大鼠肺泡巨噬细胞功能的影响[J];第二军医大学学报;2010年05期
4 刘勤;张晋宇;王露露;刘昌峨;王勇;万瑛;;慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立[J];第三军医大学学报;2008年10期
5 邱翔宇;;动物免疫失败的原因及预防措施[J];兽医导刊;2009年06期
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7 吕素芳;郭广君;魏凤;沈志强;;RNAi抑制猪主要病毒感染的研究进展[J];动物医学进展;2008年01期
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9 刘颖;冉多良;王香祖;;O型口蹄疫疫苗免疫家畜抗体水平的检测[J];动物医学进展;2008年10期
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1 吴星;口蹄疫对农产品市场的影响[N];期货日报;2005年
2 江南雪舞;谈谈口蹄疫病毒[N];大众卫生报;2005年
3 廖学时;构建感染性口蹄疫病毒粒子成功[N];医药导报(中药报);2004年
4 河北省畜牧兽医站 韩庆安(高级兽医师);春防牲畜口蹄疫[N];河北科技报;2006年
5 罗学宏;“手足口病”不是“口蹄疫”[N];家庭医生报;2007年
6 本报记者 刘丁;口蹄疫阴影下的“英国病人”[N];华夏时报;2007年
7 ;猪口蹄疫病的诊治[N];中国畜牧兽医报;2008年
8 刘书梅;春季应做好猪口蹄疫的防治工作[N];河南科技报;2007年
9 刘晔;“山羊绒洗净因素对口蹄疫病毒影响”通过鉴定[N];中国国门时报;2008年
10 郭林;口蹄疫扩大:欧盟对英出口亮红灯[N];光明日报;2007年
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1 陈豪泰;口蹄疫基因工程病毒拯救及其舌下免疫研究[D];甘肃农业大学;2012年
2 李勇;口蹄疫病毒3C(D)蛋白与宿主细胞因子Fascin-1相互作用研究[D];武汉大学;2010年
3 孙萌;口蹄疫病毒VP1抗原基因在模式植物叶绿体中的重组和表达[D];浙江大学;2003年
4 张虎;口蹄疫病毒持续感染BHK-21细胞的转录调控研究[D];武汉大学;2013年
5 吴雨霞;口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因在原核和真核细胞中的表达[D];甘肃农业大学;2003年
6 朱远茂;表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组牛疱疹病毒1型的构建及其免疫研究[D];东北农业大学;2010年
7 张艳;Asial型口蹄疫病毒宿主嗜性变异的分子基础[D];中国农业科学院;2013年
8 邵寒娟;A、O型口蹄疫双价疫苗研究[D];厦门大学;2004年
9 白兴文;我国O型泛亚1系口蹄疫病毒表型差异的分子基础[D];中国农业科学院;2012年
10 洪琦;口蹄疫—伪狂犬病二价与口蹄疫—猪细小—伪狂犬病三价基因工程疫苗的研究[D];华中农业大学;2005年
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1 张先锋;口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC、3AB、3A的克隆表达及3A蛋白间接ELISA方法的初步建立[D];新疆农业大学;2010年
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4 孙琳;MUC1肿瘤抗原和口蹄疫病毒抗体检测方法的建立[D];吉林大学;2004年
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6 田飞鹏;杆状病毒介导O型口蹄疫病毒P12A和3C基因在Sf9细胞和BHK细胞中的共表达[D];西北农林科技大学;2010年
7 杜宇;猪O型口蹄疫病毒VP_1基因的原核表达及重组蛋白的反应原性检测[D];山西农业大学;2005年
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