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《石河子大学》 2008年
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大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体构建及佐剂功能研究

唐思静  
【摘要】: 产肠毒素大肠杆菌产生的热敏性肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)具有粘膜免疫原性和免疫佐剂功能,但具有很强的毒性,只有降低或去除LT蛋白的毒性,才能有效地利用其佐剂功能。为了得到安全性好的LT蛋白,选择其毒性关键位点63、72和192进行双突变研究,以期获得无毒但具有免疫佐剂功能的热敏性肠毒素。 以pET30a-LTK63、pET30a-LTR72质粒为模板,利用重叠延伸PCR扩增技术体外获得LT双突变体LTK63/G192、LTR72/G192基因,双酶切处理双突变体和pET30a载体,构建了pET30a-LTK63/G192、pET30a-LTR72/G192表达载体,PCR和酶切鉴定出阳性质粒进行测序,结果表明构建的表达载体阅读框架正确,突变体在192位点引入甘氨酸密码子(AGA→GGA)。重组质粒转化BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,诱导表达产物用SDS-PAGE检测,各菌株均表达出约33kDa和13kDa的两个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量相吻合。 Western-blot检测,诱导表达的33KD、13KD蛋白均可与抗His抗体发生特异性免疫反应。表达蛋白用Ni-NTA Resin进行纯化,胰酶处理后,以DEABAG为底物,检测重组蛋白的ADP-核糖转移酶活性。结果,重组蛋白酶活性均显著低于野生型蛋白,而与阴性对照PBS相近。Patent-mouse毒性试验检测显示,LTK63/G192,LTR72/G192双突变体蛋白毒性均有不同程度降低,二者与LT相比差异均极显著,与PBS差异显著,且LTR72/G192的毒性略高于LTK63/G192。 LTK63/G192、LTR72/G192、LT蛋白分别与鸡新城疫低毒力活疫苗(NDV)一起经滴鼻免疫小鼠、雏鸡。经间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体、鼻液IgA抗体水平。结果,NDV与LT双突变体蛋白免疫小鼠、雏鸡的血清IgG、局部粘膜IgA抗体水平均高于单独使用NDV免疫组,且LTR72/G192组抗体水平高于LTK63/G192组。经MTT法分析鸡脾脏T淋巴细胞增殖反应,结果发现,LT及LT双突变体蛋白免疫组的T淋巴细胞增殖反应均高于单独使用NDV免疫组及PBS空白对照但,但LTR72/G192与NDV免疫组T淋巴细胞增殖能力最强。 研究获得了减毒LT双突变体LTR72/G192、LTK63/G192表达载体,并证实其表达产物ADP-核糖转移酶活性和Patent-mouse毒性均低于LT野生性蛋白,且均具有良好粘膜佐剂活性,为临床开发其利用粘膜免疫佐剂功能奠定了基础。
【学位授予单位】:石河子大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S852.5

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【共引文献】
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【二级引证文献】
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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