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《新疆医科大学》 2010年
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移植胰岛细胞和骨髓单个核细胞治疗糖尿病实验研究

韩玮  
【摘要】:背景:1型糖尿病(IDDM)是自身免疫引起的胰岛素分泌细胞数量减少的疾病,可导致患者血糖升高引起并发症的发生,包括心血管疾病、失明、肾衰竭。这类病人通常需要每天注射胰岛素控制血糖,但是使用胰岛素有可能引起低血糖、晕厥、麻痹甚至死亡等意外的发生。Lacy于1982年进行了第1例胰岛移植,由于胰岛细胞移植成功率较低,结果不甚理想,这种技术的应用受到一定限制,直到2000年Edmonton胰岛细胞移植方案建立之后,移植的成功率才有了极大的提高。尽管这样,胰岛细胞移植仍然面临许多困难,首先是供体的短缺,其中不到1%的患者能够得到供体进行移植,其次胰岛细胞移植的适用症逐渐扩大,其中包括了胰腺肿瘤、慢性胰腺炎的病人,这样就使供体短缺更加严重。目的:1)对比非禁食与禁食后腹腔注射链脲佐菌素(50mg/kg)诱导糖尿病大鼠2周后的模型存活率;2)对比预冷(4℃)胶原酶灌注法与Hanks灌注法消化后胰岛细胞的获得量;3)本实验对比通过尾静脉、肝脏和胰腺三种途径移植胰岛细胞、骨髓单个核细胞治疗糖尿病的效果;4)观察骨髓单个核细胞在免疫排斥反应中的抑制作用;5)观察细胞种类与移植途径之间的关系。方法:1)Wistar大鼠48只,6-8周,体重约200-250g,雌雄不限,非禁食经腹腔单次注射链脲佐菌素溶液(STZ,50mg/kg),冰浴和避光,并于30分钟内完成,注射后大鼠头部向下倒置约30秒,放回饲养笼内自由进食水,用血糖仪连续测定2次,随机血糖均≥16.8mmol/L,出现典型的糖尿病临床症状:多饮、多食、多尿、体重下降,认为造模成功;2)大鼠麻醉后,开腹逆行灌注切取胰腺后剪碎,大小约1×1×1mm3,移入提前预热的装有10ml胶原酶V溶液的锥形瓶内,于37℃水浴箱内120—180回/min震荡消化15~20min,取少量细胞上清液于倒置显微镜下观察,如呈单个胰岛细胞团,并与间质组织脱离,可吸出上清液,加入预冷的Hanks缓冲液50ml终止消化,手动强烈振荡离心管,使胰岛细胞与间质充分脱离,剩余胰腺组织可加入胶原酶V溶液2-5ml继续消化;如胰岛细胞与间质组织未脱离,可继续消化,随时观察胰腺组织消化情况,直至消化完全。消化结束后将细胞悬液轻柔吹打均匀,用80目细胞滤网过滤,将过滤后的细胞悬液移入50ml离心管中,在低温离心机中(4℃),1500r/min的转速下离心4min,重复洗涤2次,沉淀即为消化的胰腺组织。将25%的Ficoll400溶液4ml加入消化洗净的胰腺组织中,轻柔充分混合均匀,然后依次缓慢加入23%、20%、10%的Ficoll400溶液各2ml,1500r/min,离心10 min,纯化的胰岛细胞集中于23~20%和20-10%之间,小心吸取收集,Hanks液重复洗涤2次,双硫腙染色计数1000个备用;3)切取上述大鼠四肢骨,装入培养皿中置于超净工作台上,取出四肢骨放入装有双抗PBS10ml的离心管中,浸泡15min后取出,再放入装有10mlPBS的15ml离心管中,浸泡10min取出,用咬骨钳剪去两端骨骺,用含有10%胎牛血清(FBS)的L-DMEM溶液5ml冲洗骨髓至培养皿中,直至骨头发白,再换用26G的注射器吹打两次,使之成为单细胞悬液,在15ml的离心管中加入5ml淋巴细胞分离液,再将单细胞悬液缓慢加入淋巴细胞分离液之上,缓慢加样保持液面层清晰,1600r/min密度梯度离心20分钟分离骨髓单个核细胞(BMMC),用直头滴管吸出液面层之间的单个核细胞,加入Hanks缓冲液10ml,1600r/min离心洗涤4min,重复2次,2%台盼蓝染色细胞,正置显微镜下计数,调整成所需浓度的细胞悬液(1×107/ml),移植备用;4)模型制作成功后随机分组,A组肝脏被膜下移植1000个胰岛细胞,B组肝脏被膜下移植1000个胰岛+1×107骨髓单个核细胞,C组经尾静脉移植1000个胰岛细胞,D组经尾静脉移植1000个胰岛细胞+1×107骨髓单个核细胞,C组和D组移植之后在腹部切小切口并缝合,E组胰腺被膜下移植1000个胰岛细胞,F组胰腺被膜下移植1000个胰岛+1×107骨髓单个核细胞,各组移植后皮下注射青霉素20万单位预防感染。分别于移植前1天、第0、1、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天,观察并记录模型大鼠血糖变化。血糖测定结束后,处死大鼠切取胰腺、肝脏、肺脏、脾脏组织器官,观察脏器大体形态后,修剪并切取部分组织,置于4%多聚甲醛固定4-6h,常规脱水,石蜡包埋,常规石蜡制片,苏木精-伊红(HE)染色,观察组织病理变化。数据处理采用SPSS17.0统计分析。结果:1)非禁食腹腔注射链脲佐菌素(50mg/kg)大鼠均可成模,血糖≥16.8mmol/L,模型成模率为100%,且较非禁食组模型稳定;2)分离纯化后的胰岛细胞经双硫腙(DTZ)染色鉴定并计数,胰岛细胞呈猩红色圆形或团块状,细胞体积较小且致密,与外分泌腺体细胞分离,外分泌腺体细胞体积较大,双硫腙不着色,细胞折光性强,通过计数胰岛细胞回收率约为60-70%,纯化后的胰岛细胞纯度较高,可达90%以上,每只大鼠可获得(520±53)个胰岛;3)淋巴细胞分离液分离的骨髓单个核细胞,经2%台盼蓝染色后在正置显微镜下观察,细胞呈折光性强,圆形,细胞纯度较高,死细胞呈淡蓝色;4)肝脏被膜下移植胰岛细胞大鼠血糖于术后3天内开始下降至正常,下降趋势较明显,A组血糖可降至正常水平,平均血糖为(7.98±2.28)mmol/L,可维持(3.71±0.95)天,B组可降至正常水平,平均血糖为(7.72±1.75)mmol/L,可维持(4.86±1.06)天,C组经尾静脉移植胰岛细胞大鼠血糖于术后4天内降至正常,下降趋势较肝脏组缓慢,血糖可降至正常水平,平均血糖为(7.35±1.40)mmol/L,可维持(7.85±1.46)天,D组于移植后4天内起效,血糖可降至正常水平,平均血糖为(7.00±0.83)mmol/L,可维持(14.1±1.21)天,E组移植后24小时血糖降至正常水平(7.06±2.11)mmol/L,可维持(24.90±2.60)天,F移植后24小时血糖降至正常水平(8.21±1.22)mmol/L,可维持(39.80±2.57)天,经重复测量设计的方差分析表明各组间血糖随时间变化的趋势不同(P0.05),各组血糖维持正常水平的时间不全相同(P0.05),血糖变化趋势与移植途径之间有交互作用;5)糖尿病大鼠胰腺组织大体标本见胰腺体积缩小,颜色与周围脂肪相似。病理切片经HE染色后显示胰腺组织中可见散在分布的胰岛细胞,数量减少,胰岛细胞体积减小,与周围外分泌腺细胞对比界限较明显。糖尿病大鼠肝脏组织大体标本见肝叶饱满,切面呈红褐色。病理切片经苏木素-伊红染色(HE染色)后显示肝脏被膜下移植后出现严重的炎症反应,呈现局灶样炎症坏死,炎症细胞浸润到肝脏内。结论:1)本实验采用非禁食腹腔注射链脲佐菌素(50mg/kg)制作糖尿病大鼠模型,成模率高,模型稳定,模型鼠随机血糖均高于16.8mmol/L,胰腺组织形态学变化明显;2)本实验采用预冷的Hanks灌注胰腺分离胰岛细胞,胰岛细胞形态呈圆形或团块状,回收率尚可,可以保护胰岛细胞的完整;3)本实验在胰腺部位移植胰岛细胞较肝脏被膜下、静脉移植维持血糖正常的时间长,提示通过在胰腺被膜下移植是一种理想的移植方式;4)骨髓单个核细胞表现出一定的免疫抑制作用;5)联合移植较单纯移植纠正血糖效果理想;6)在肝脏部位移植胰岛细胞易发生炎症反应,导致胰岛细胞凋亡。
【学位授予单位】:新疆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R587.1

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