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《新疆医科大学》 2011年
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新疆大蒜种质资源鉴定及规范化种植研究

关明  
【摘要】:目的:大蒜(Allium sativum L.)具有多重功效,是国内外医药保健品、食品加工等领域的研究热点。新疆地处大蒜的原产地——中亚,其地产大蒜是优势药用植物资源,在国际上被称为“高蒜氨酸大蒜”。本研究旨在阐明新疆地产大蒜与内地部分省区大蒜以及新疆不同品种大蒜之间的亲缘关系,为新疆优势药用大蒜的筛选提供分子水平的佐证;比较不同品种大蒜的品质优劣和差异,为筛选优质种质提供参考;制订操作规程,为大蒜规范化种植提供借鉴;为新疆优势药用大蒜的GAP规范化种植、优良育种及种质资源保护提供依据。 方法: 1)大蒜种质资源RAPD遗传多样性分析 采用CTAB法提取大蒜基因组DNA,利用核酸蛋白分析仪与琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量;PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳筛选RAPD随机引物;优化PCR反应条件和反应程序,建立大蒜RAPD-PCR优化反应体系;利用Quantity One软件结合人工方法读带,建立0、1二元原始数据矩阵;采用POPGENE1.32软件计算样品的多态性位点比率、有效等位基因数(Ne)、Nei基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(I);采用NTSYSpc 2.10e软件计算样品的遗传相似系数,按UPGMA法进行聚类分析,建立树状图,并进行主成分分析,建立二维散点图。 2)不同品种大蒜化学组分分析 采用高效液相色谱法测定不同品种大蒜中蒜氨酸、潜在大蒜辣素的含量,并测定含水量,对测定结果进行聚类分析;采用傅里叶变换红外光谱仪获取各样品的红外谱图及不同波数下的透过率数据,运用主成分分析及聚类分析对谱图数据进行分析;筛选和优化高效薄层色谱条件,建立大蒜高效薄层色谱指纹图谱,利用指纹图谱解决方案软件确认共有峰,结合主成分分析与聚类分析进行相似度比较。 3)不同品种大蒜的显微鉴别 制作石蜡切片,借助显微照片对大蒜鳞芽组织细胞及鳞芽表皮细胞进行观察和比较鉴别。 4)大蒜规范化种植初步研究 采用环境监测方法和仪器分析技术对吉木萨尔县大蒜种植基地进行环境质量监测与评价;采用高效液相色谱法对大蒜活性成分进行动态检测;采用高效液相色谱法、高效薄层色谱法等修订大蒜药材质量标准(草案)的部分内容;通过田间跟踪记录并结合上述实验结果与长期实践经验制订大蒜规范化种植操作规程(草案)。 结果: 1)大蒜种质资源RAPD遗传多样性分析 PCR反应总体积25μl,模板DNA 50 ng,引物10 pmol,dNTP 10μmol,MgCl_2 50μmol,Taq DNA聚合酶1.5U,10xPCR反应缓冲液2.5μl,以重蒸馏水补充至25μl;反应程序为94℃预变性3 min,(94℃变性45 s,36℃退火1min,72℃延伸l.5min),共40个循环,72℃最终延伸7min,4℃保存;从47个RAPD随机引物筛选出条带清晰、多态性明显、重复性好的10个引物,多态性比率为68.29%,Ne =1.2993,H = 0.1916,I = 0.2942;通过分析大蒜RAPD指纹图谱中的条带,可将样品聚为第Ⅰ和第Ⅱ两大类。新疆地产大蒜样品聚为第Ⅰ大类,包括四类:第一类以天山以北地区的样品为主,蒜氨酸含量一般;第二类以天山以南地区的样品为主,蒜氨酸含量高;第三类仍以天山以南地区的样品为主,蒜氨酸含量较高;第四类以新疆东部地区的样品为主,蒜氨酸含量较低;山东、河南等内地大蒜样品聚为第Ⅱ大类,即第五类。 2)不同品种大蒜化学组分分析 不同品种大蒜的蒜氨酸、潜在大蒜辣素等活性成分含量差异显著,新疆天山以南地区阿合奇县与乌什县的大蒜样品活性成分含量最高,为优势药用大蒜,按蒜氨酸、潜在大蒜辣素含量的高低可聚为四至五类;傅里叶变换红外谱图数据分析显示不同品种大蒜化学组分整体信息的相似度为76.3%~99.8%,样品可分为五大类,新疆天山以北伊犁地区样品聚为一类,天山以南地区样品聚为一类,东部地区样品聚为一类,内地样品基本聚为一类;确定正丁醇-正丙醇-冰醋酸-水(3:1:1:1)为高效薄层色谱展开剂,共指认9个特征色谱峰,不同品种大蒜在化学组分相对含量和比例上有不同程度差异,样品可分为五大类,新疆境内的大蒜样品基本以天山山脉为分化基础。 3)不同品种大蒜的显微鉴别 通过显微照片观察和测量发现:天山以南地区大蒜样品的鳞芽表皮细胞及气孔较大,天山以北地区大蒜样品的鳞芽表皮细胞及气孔大小居中,而新疆东部地区与内地大蒜样品则偏小;大蒜鳞芽组织细胞的大小呈现相同规律。 4)大蒜规范化种植初步研究 吉木萨尔县大蒜种植基地环境质量良好,达到大气环境质量一级标准、土壤质量二级标准、农用灌溉水质量标准,大蒜样品中Ca、Se含量高,As含量未超过国家标准限值,Mn、Cr含量低,未检出Pb、Cd;动态检测结果表明,大蒜逐渐成熟的8月至10月间,9月时的蒜氨酸含量达到了最高值,含水量降至最低,储存期内的12月,潜在大蒜辣素的含量达到最高值;确定0.04%三氟乙酸为高效液相色谱流动相,蒜氨酸为对照品,大蒜供试品高效薄层色谱中,在与蒜氨酸及L-精氨酸对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,大蒜药材水分均值为58.2%,酸不溶性灰分均值为0.38%;初步实施操作规程后,效果良好,三年间大蒜中蒜氨酸的含量有所回升。 结论: 1)地理和环境因素是影响大蒜遗传变异的主要因素。不同品种的大蒜具有较为丰富的遗传多样性,新疆境内的大蒜样品保持较近的遗传关系,并主要以天山山脉为分化基础,而山东、河南等内地大蒜样品与新疆境内大蒜样品的亲缘关系较远。 2)化学组分分析的聚类结果与RAPD分子标记遗传多样性分析的聚类结果保持一致。新疆境内天山以南地区乌什县和阿合奇县的大蒜样品药用优势明显,可以作为优质种质进行进一步研究开发。 3)吉木萨尔县大蒜种植基地符合GAP规定的基地环境质量要求,适宜发展成为大蒜GAP种植基地;建议9月进行大蒜采收,12月进行原料加工;大蒜药材质量标准应以蒜氨酸为对照品,并需增加水分和酸性不溶性灰分两项检查内容;操作规程规范了吉木萨尔县大蒜种植基地的生态环境和大蒜栽培技术等技术要求,可以继续完善并推广。
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