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TGF-β与Th类细胞因子的“对话”在泡球蚴感染所致宿主病理损伤中的作用机制研究

王俊华  
【摘要】:目的:探讨TGF-p与Th类细胞因子的“对话”在泡球蚴感染所致宿主病理损伤中的作用。方法:1)肉眼直视下肝脏穿刺建立泡球蚴感染小鼠模型:8-10周龄雌性BALB/c小鼠,随机分为实验组和对照组。乙醚麻醉,实验组开腹直视下肝左叶注射0.1mL泡球蚴混悬液,丝线缝合关闭腹腔。对照组相同部位注射等量生理盐水。感染2、8、30、60、90、180、270、360天处死小鼠,两组均在肝左叶相同部位采集标本;2)采用36k小鼠全基因组寡核苷酸芯片分析BALB/c小鼠肝泡球蚴感染动物模型,肝脏基因mRNA转录本含量的改变;确定目标基因并联机检索GeneBank等整合数据库,按其生物功能进行分类。应用Gene Cluster3.0生物信息可视化分析软件进行等级聚类分析。筛选肝脏免疫相关基因;3)泡球蚴病人和泡球蚴感染小鼠肝脏组织,福尔马林固定、石蜡包埋,4μm连续切片。HE染色观察病理变化,免疫组化方法、Western Blot和实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1、Smads、MAPK、肝细胞增殖和凋亡相关蛋白及mRNA的表达与分布,原位末端标记技术(TUNEL)检测病灶肝细胞凋亡;4)原位肝脏灌注法分离大鼠肝细胞,与泡球蚴囊液共培养,15min、30min、1h、2h、24h收集细胞,Western Blot检测TGF-β1、Smads、MAPK相关蛋白的表达。结果:1)随着泡球蚴感染时间的延长,肝损伤逐渐增加,肝纤维化程度增加,TGF-β1在泡球蚴感染所致的肝纤维化中具有促进作用;2)泡球蚴感染早期以Thl免疫反应为主,感染中期呈现出混合的Th1/Th2免疫反应,感染晚期免疫反应降低,化学趋化因子在泡球蚴感染过程中发挥着重要的作用,病灶旁肝组织促进了细胞因子和化学趋化因子的产生和活性;3)在泡球蚴感染早期,IL-17A和IL-17F在病灶炎性带组织和病灶旁肝组织中均高表达,感染晚期IL-17A表达低于对照组,而IL-17F的表达虽有所降低,但仍高于对照组;4)泡球蚴感染激活宿主肝细胞TGF-p/Smad信号通路,造成了肝纤维化;5)在泡球蚴感染的早期,以ERK1/2信号通路被激活,促进肝细胞的增殖;在感染的中期,以Gadd45β高表达,调控肝细胞的抗凋亡;在感染的晚期,以细胞凋亡蛋白p53、p21高表达,肝细胞发生生长抑制或凋亡。结论:1)泡球蚴感染TGF-P高表达,引起机体免疫抑制状态的形成,造成泡球蚴的“免疫逃避”,同时导致宿主肝脏发生病理性损伤;2)泡球蚴感染早期以Thl免疫反应为主,感染中晚期呈现出混合的Th1/Th2免疫反应,化学趋化因子在泡球蚴感染过程中也发挥着重要的作用,病灶旁肝组织促进了细胞因子和化学趋化因子的产生和活性;3)首次证明细胞因子和化学趋化因子,尤其是IL-17,在泡球蚴感染病灶旁炎性带和病灶旁肝组织发挥着重要的作用,结果提示TGF-β对IL-17不同的亚型表达及Treg具有调控作用,调节T细胞向特定方向分化,并诱导免疫细胞发生凋亡,从而介导泡球蚴的免疫逃避,同时造成宿主组织损伤;4)我们的研究结果的提示,在泡球蚴感染宿主肝脏过程中,泡球蚴感染引起宿主炎症反应或泡球蚴自身,分泌TGF-β及炎症/抗炎症细胞因子,激活下游Smad信号通路,从而导致宿主肝脏发生纤维化;5)在泡球蚴感染宿主肝脏的过程中,泡球蚴通过直接刺激(囊液中的有害成分、原头蚴本身分泌的某些成分)或间接(引起宿主免疫系统分泌的TGF-β及相关细胞因子)刺激,产生细胞毒性,造成宿主细胞应激反应,激活宿主肝细胞MAPK信号通路(ERK和JNK信号通路)和细胞周期相关调控因子,影响宿主肝细胞周期、引起宿主肝细胞增殖、生长抑制、凋亡和肝细胞功能改变等,最终导致宿主“肝肿大(感染早、中期)”或肝脏萎缩、变性甚至坏死(感染晚期);6)在泡球蚴感染的早期,以ERK1/2-Cyclin D1为主线的信号通路调控肝细胞的增殖;在感染的中期,以ERK1/2-Gadd45β (Cyclin A)-PCNA为主线的信号通路调控肝细胞的抗凋亡;在感染的晚期,以p53-p21-Cyclins和p53-Gadd45y-JNK为主线的信号通路调控肝细胞的生长抑制或凋亡,从而造成宿主病理性肝损伤。


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