瘤果黑种草子总黄酮提取工艺优化及抗肿瘤作用研究

【摘要】：目的:本课题采用响应曲面法优化瘤果黑种草子总黄酮的提取工艺,检测瘤果黑种草子总黄酮体外抗肿瘤细胞增殖能力和体外抗肿瘤细胞迁移能力,进行自噬相关基因的检测,探讨瘤果黑种草子总黄酮体外抗肿瘤活性的作用机制。方法:选取甲醇体积分数、提取时间、提取温度等3个因素为考察指标,采用响应面法分析优化瘤果黑种草子总黄酮的提取工艺。经瘤果黑种草子药物干预人结肠癌细胞株SW480、人结肠癌细胞株Caco-2、人乳腺癌细胞株MCF-7和人脑胶质瘤细胞株U251,采用MTT法检测瘤果黑种草子总黄酮体外抗肿瘤细胞增殖能力;用倒置显微镜观察对人结肠癌细胞株SW480、人结肠癌细胞株Caco-2、人乳腺癌细胞株MCF-7和人脑胶质瘤细胞株U251细胞形态的影响。通过划痕实验检测对肿瘤细胞迁移能力的影响,并进一步使用荧光定量PCR方法检测自噬相关基因。结果:1.响应面法优化瘤果黑种草子总黄酮提取工艺:甲醇体积分数61%、提取时间1.5 h、提取温度74℃、料液比1:25 g/mL,在此条件下瘤果黑种草子总黄酮得率的平均值2.2314 mg/g。2.瘤果黑种草子总黄酮体外抗肿瘤细胞增殖能力的检测:瘤果黑种草子总黄酮对人结肠癌细胞株SW480、人结肠癌细胞株Caco-2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人脑胶质瘤细胞株U251的增殖均有抑制作用。瘤果黑种草子总黄酮对人结肠癌细胞株SW480、人结肠癌细胞株Caco-2在药物浓度为15μg/mL时开始起效(P0.05),之后随着药物浓度的升高瘤果黑种草子总黄酮对人结肠癌细胞株SW480、人结肠癌细胞株Caco-2的抑制率也不断升高,呈现良好的量效依赖关系;瘤果黑种草子总黄酮对人人乳腺癌细胞株MCF-7、人脑胶质瘤细胞株U251在药物浓度为10μg/mL时开始起效(P0.05),之后随着药物浓度的升高瘤果黑种草子总黄酮对人乳腺癌细胞株MCF-7、人脑胶质瘤细胞株U251的抑制率也不断升高,呈现良好的量效依赖关系。3.瘤果黑种草子总黄酮体外抗肿瘤细胞迁移能力的检测:药物干预24 h时后,人结肠癌细胞株SW480、人结肠癌细胞株Caco-2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人脑胶质瘤细胞株U251空白对照组划痕处细胞趋于汇合,各药物干预组划痕处变化不大。各药物干预组肿瘤细胞迁移距离比各空白对照组小,且差异有统计学意义(P0.05)。4.自噬相关基因的荧光定量PCR检测结果显示:与空白对照组相比,人结肠癌细胞株SW480、人乳腺癌细胞株MCF-7各药物干预组自噬相关基因BECN1的相对表达量均有不同程度的上升;人结肠癌细胞株Caco-2、人脑胶质瘤细胞株U251各药物干预组自噬相关基因BECN1的相对表达量均有不同程度的下降;且差异均具有统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比,人结肠癌细胞株SW480、人结肠癌细胞株Caco-2、人乳腺癌细胞株MCF-7各药物干预组自噬相关基因MAPILC3B相对表达量较空白对照组均有所上升;人脑胶质瘤细胞株U251各药物干预组自噬相关基因MAPILC3B相对表达量较空白对照组均有不同程度的下降;且差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:综上,响应面法优化了瘤果黑种草子总黄酮提取工艺。瘤果黑种草子总黄酮在体外对人结肠癌细胞株SW480、人结肠癌细胞株Caco-2、人乳腺癌细胞株MCF-7和人脑胶质瘤细胞株U251的增殖具有抑制作用。瘤果黑种草子总黄酮在体外对人结肠癌细胞株SW480、人结肠癌细胞株Caco-2、人乳腺癌细胞株MCF-7和人脑胶质瘤细胞株U251的迁移有抑制作用。实时荧光定量PCR结果初步揭示了诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡可能是瘤果黑种草子总黄酮体外抗肿瘤作用的机制之一。