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《新疆医科大学》 2002年
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砷诱导NIH3T3细胞转化分子机制的体外实验研究

胡宇  
【摘要】: 砷及其化合物广泛地存在于自然界,且应用于工农业生产中。砷作为类金属元素,同时具有金属和非金属的特性。人类暴露于砷主要是通过消化道和呼吸道以及少量通过皮肤吸收。 目前世界范围约有一亿人(我国约有560~1466万人,其中近五年内发现的病区人口达150万)受到砷污染的威胁。长期接触砷不仅可引起皮肤,心血管等多系统的损害,而且与肺癌,皮肤癌和膀胱癌等发生有关。世界卫生组织(WHO)对砷的危害十分重视,将其列为环境治理的重点化学物质。 砷致癌虽已得到大量流行病学研究的证实但到目前为止仍未得到可靠的动物实验证实。有关砷的作用机制仍不清楚。虽然国内外分别从砷对DNA损伤,DNA修复和DNA甲基化模式的影响,砷引起的基因突变,染色体畸变,癌基因和抑癌基因表达的改变等方面进行了探讨。但砷致癌的分子机制研究仍然没有实质性的进展,随着世界卫生组织对砷卫生标准修订的工作进展需求,低剂量,长期接触砷的危害及其致病机制已成为非常重要和迫切的研究内容。 本课题结合已有的工作基础,利用细胞分子生物学技术通过建立砷诱导细胞转化模型,探讨砷致细胞氧化还原状态改变进而引起与细胞氧化还原相关谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统酶活性和基因表达的改变与砷诱导细胞转化的关系;并结合分析原癌基因和抑癌基因在砷诱导细胞转化中的作用,为探索砷致癌机制提供依据。 目的: 1.为研究砷暴露与致癌的机制,我们选择NIH3T3小鼠成纤维细胞作为研究对象。通过进行砷细胞毒性实验,确定砷细胞毒性的LC_(50) 砷诱导NIH3T3细胞转化分了机制的体外实验研究(中文摘要) 并以此为基础进行细胞转化实验,建立砷诱导细胞转化模型,为随后 进行砷诱导细胞转化的分子机制研究提供研究模型。 二.探讨急、慢性砷暴露对NIH 3T3 细胞氧化还原状态的影响进 而对细胞GSH水平及其相关酶活性和基因表达的影响,并说明砷与 GSH的相互作用在砷诱导转化中的可能作用。 3.研究急、慢性砷暴露对硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶基因 表达的影响,及其与砷诱导的细胞转化的关系,同时砷与 TPA和 H。O。 的相互作用也作为研究内容一并研究以比较砷与其它促癌物(TPA) 和氧化紧张物(HZOZ)对硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶基因表达的 影响。 4.分析急、慢性砷处理对原癌基因叫un,cl 和抑癌基因p53 的影响,并试图说明其在砷诱导细胞转化方面的可能作用。 通过上述研究为砷诱导细胞转化的分子机制提供依据。 方法: 1.首先通过中性红摄入实验,选择 0,0.l,0.5,1,5,10,25, 50,100卜MAS*山剂量组,染毒24h后确定细胞生存率(通过染毒组 与对照组 的比值(%)进行计算并作细胞毒性曲线。根据上述细胞砷 毒性实验的结果确定LC50,并以可使经24h染毒仍有95%以上的细胞 存活的剂量作为诱导细胞转化试验的剂量。本课题分别选择0.l, 0.spM AS*)作为诱导剂量。每周换培养液一次,并以 1:10的比率 传代细胞。继续以相同剂量染毒诱导。与此同时设立两个对照组同步 进行培养和传代。观察比较处理组的对照组细胞的形态,生物学生长 特性,细胞砷毒性的变化,并进行半固定琼脂生长实验以确定细胞转 化模型。 2.将不同剂量砷处理时点的细胞,移去培养液并用PBS缓冲液 洗两次,然后用收集细胞于 PBS缓冲液中,离心(1000r/min)smin, 弃取上清液j入 500HI PBS缓冲液并置于冰上 5 min,超声破碎细胞。 然后于 2-8℃离心(13000r/min)30 min,分装上清液 20卜1/份。保 存于-80丫以备测。采用经过改进的Clark法测定细胞中谷眺甘肽 一2—— 砷诱导NIH3T3细胞转化分子机制的体外实验研究(中文摘要) (GSH)水平;采用Styblo所介绍的Thomas法测定谷眈甘肽还原 酶旧R) 活性:通过分光光度法测定谷脱甘肽与卜氯-2.个二硝基苯 (CDNB)的结合测定谷腴甘肽转移酶(GST)活性。 3.在各不同剂量处理时点准备全细胞提取物,并通过BioRad公 司蛋白测定试剂盒分析样品蛋白含量。各处理组10-20pg样品蛋白通 过采用SDS 聚丙稀酷胺凝胶电泳和固定化蛋白质的免疫学测定 (Western Blot)法坝定血红素氧化酶(HO一l),原癌基因叫un,c一fos, 和抑癌基因p53蛋白质表达。 4.根据谷眺昔肽还原酶(GR),谷肌昔肽过氧化物酶(GPX), 硫氧还蛋白(TRXX硫氧还蛋白还原酶(TRL和抑癌基因p53基因特异 序列设计 GR,GPX,TRX,TR-l,TR—2,禾 p53 PCR弓物。应用上 述引物通过第一CDNA单连合成试剂盒(AWV BOChfillgCf M。lllhClm 公司)反转录(RT-PCR)合成相应的 DNA,然后经 1%普通琼脂糖电 泳分离PCR产物,切胶并经过QIAGEN 11 DNA纯化法纯化PCR产 物,用 a刁2pdCTP标记探针;采用 QIAGEN RNAeasy纯化方法在各 不同剂量砷处理时点提取细胞总 RNA。通过Northern Blot(RNA印迹 法)测定谷眯昔肽还原酶(GR)和谷耽昔肽过氧化物酶(GPX),硫氧 还
【学位授予单位】:新疆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R730.2

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