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《新疆医科大学》 2004年
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新疆维吾尔妇女宫颈癌组织HPV16基因分子检测的研究

马彩玲  
【摘要】:目的:人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus,HPV16)是诱发妇女宫颈癌的启动因子,并与人类多种恶性肿瘤的发生密切相关。它的早期基因E6、E7是致癌的关键基因,在宫颈细胞中持续表达并为其癌化表型的维持所必需。新疆是我国宫颈癌高发区,新疆南部维吾尔妇女宮颈癌与HPV16感染密切相关,为进行新疆妇女宫颈癌病因研究及宫颈癌的预防及早期诊断,本文对新疆维吾尔妇女宫颈癌组织进行了HPV16 E6及E7基因的分子检测研究。为进一步了解新疆妇女宫颈癌组织中HPV16E6基因的结构特点,本研究对来自新疆的宫颈癌患者手术或活检标本中的HPV16E6基因进行了克隆及一级结构分析;对新疆地区宫颈不同病变组织进行了HPV16E6、E7基因检测;荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)分析,探索新疆妇女宫颈不同病变组织中HPV16E6、E7基因的相对含量与病情变化的关系,为宫颈癌的筛查、早期诊断、预防及愈后评估提供新的分子生物学的方法。HPV16E6、E7蛋白是肿瘤特异性排斥抗原,是设计HPV疫苗公认的靶抗原。本研究开展新疆维吾尔妇女宫颈癌组织中HPV16E6、E7基因的克隆,融合蛋白的原核表达及准备抗血清的制备,为HPV16相关疾病的血清学诊断及HPV16E6、E7的疫苗研究提供物质基础。近年来,有关纳米材料的合成和应用方面的研究工作进展迅速,特别是纳米金,在分子领域的应用已成为研究的热点。研究采用固定于硅烷化片基上的捕获探针,特异性结合单链人乳头瘤病毒16型新疆株E6基 新猎医科大学博士学位论文 因(HPV 1 6E6)扩增片断,再与互补的纳米金颗粒标记的探针结合, 通过银染加强显色,初步建立了金标银染法快速检测HPv 1 6E6 DNA 的技术。从而为新疆妇女宫颈癌病因研究及宫颈癌的预防、诊断及治 疗的研究提供科学的理论依据。 方法:从浸泡在福尔马林的宫颈癌组织(10例)及福尔马林浸泡后 石蜡包埋的宫颈癌(59例)、宫颈上皮内瘤变(eervical intraepithelial neoplasia,CIN65例)及宫颈炎(33例)组织中提取DNA;另外对一批 妇科门诊患者(96例)随机取宫颈管的脱落细胞及分泌物,作为对照, 用聚合酶链式反应(PCR)检测各组宫颈组织中人乳头瘤病毒16型 E6基因(HPV 1 6E6)。从19份新疆维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本 中提取组织DNA,作为模板,PCR扩增HPV 1 6E6全长基因,PCR产 物直接测序或克隆后测序,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织 HPV16E6基因的突变。以新疆妇女宫颈不同病变组织为源材料,以人 乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因(HpV 1 6E6,AF327851)及HPvl6E7 基因作为扩增的靶基因,同时以人p一actin基因片段作为内参照,借 助于设计的目的基因引物,两个特异的荧光探针,在筛选的FQ一PCR 优化反应体系中,同时对两个基因片段进行扩增,得到HPV 1 6E6及 HPV 1 6E7基因的相对含量。使用本实验室从新疆维吾尔族妇女宫颈癌 组织中克隆的人乳头瘤病毒16型的E7基因(HPV16E7),以pGEX一ZT 载体和大肠杆菌BL21(DE3)原核蛋白表达系统表达HPV16E7融合蛋 白(GST,HPV16E7),经亲和纯化定量后得到大量的GsT一HPv16E7融 和蛋白。根据HPV 16(新疆株)E6基因编码序列设计引物,从含有 HPV 1 6E6基因的质粒中扩增出含HPV 1 6E6基因的DNA片段,将所 得片段与pMD 18一T载体连接,转化到JM109大肠杆菌中,筛选的阳 性克隆扩增后,提取质粒DNA,酶切,回收目的片段,定向克隆到 PET28a中,转化JM109受体菌,从JM109受体菌中提出质粒,再转 化到BLZI(DE3)中,筛选出转化体,用IPTG诱导表达,在PAGE上 见到所表达的18kD的特异性的HPv16(新疆株)E6蛋白条带。从而为 人乳头瘤病毒16型的诊断、检测、疫苗研制等方面的研究提供了物质 基础。研究采用固定于硅烷化片基上的捕获探针,特异性结合单链人 一2一 中文摘要 乳头瘤病毒16型新疆株E6基因(HPV 1 6E6)扩增片断,再与互补的 纳米金颗粒标记的探针结合,通过银染加强显色,初步建立了金标银 染法快速检测HPV16E6 DNA的技术,同时辅以Real一time定量PCR、 地高辛斑点杂交进行平行比较和评价,确认了金标银染法检测的有效 性。 结果:PCR结果宫颈癌蜡块组织59例中HPv16E6阳性37例(阳 性率62.7%);宫颈上皮内瘤变(cIN)组织65例中HPv16E6阳性37 例(阳性率56.92%);石蜡包埋宫颈炎组织共33例,HPV16E6阳性 22例(阳性率“.67%);而宫颈管脱落细胞及分泌物共%例,HPV16E6 阳性3例(阳性率3.13%)。荧光定量PCR结果宫颈癌蜡块组织59例 p一actin均阳性,证实DNA提取方法可靠。从19份新疆维吾尔族妇 女宫颈癌活检组织标本中提取组织DNA,作为模板,P CR扩增 HPV 16E6全长基因,PCR产物直接测序或克隆后测序,14个E6分 离片断的测序和序列分析表明,7个(50%)分离株E6基因与原型相 同,5个(35.71%)分离株发生了L83V突变;2个(14.29%)分离株 发生了L83V/D63E突变,HPV16E6原型和L83V突变型在宫颈癌组 织中的分布与其在北美洲的分布接近。对FQ·PCR反应结果中p一actin 阳性的宫颈不同病变组织中HPV16E6阳性率及其相对含量进行统计 分析,宫颈癌蜡块组织59例,HPV 1 6E6阳性率83 .05%;宫颈上皮内 瘤变(CIN)蜡块组织65例,HPV16E6阳性率75.68%;宫颈炎蜡块 组织33例,HPV 1 6E6阳性率93 .33%,宫颈脱落细胞标本%例, HpV 1 6E6阳性率3 .29%。pCR及F
【学位授予单位】:新疆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R737.33

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