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《新疆医科大学》 2010年
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shRNA干扰食管癌Eca109细胞ERK2表达的实验研究

霍奇  
【摘要】:目的:构建针对细胞外信号调节激酶2(Extracellular Signal- regulated Kinase2, ERK2)基因短发夹式RNA(shRNA)及其表达载体,转染人食管癌细胞Eca109,观察其对食管癌细胞Eca109中ERK2基因沉默效果和增殖的影响及其可能的作用机制。方法:利用Western-blot方法检测含10%胎牛血清培养液刺激和ERK2抑制剂U0126(10μM-50μM)对食管癌细胞Eca109的p-ERK2表达的影响。在Genebank中筛选ERK2基因siRNA干扰的靶向序列,设计并合成含有发夹结构的60个碱基序列的寡核苷酸链,寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到pGeneClipTM载体上,构建重组质粒(简写为shRNA- ERK2),并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。利用核酸转染试剂Lipofectamie 2000转染食管癌细胞Eca109,荧光倒置显微镜和四甲基偶氮唑蓝比色试验(MTT法)分别观察转染24h、48h、72h、96h的转染效率和细胞增殖活力。将食管癌细胞Eca109分为转染ERK2靶向序列实验组、非特异序列组、脂质体组及抑制剂U0126对照组,采用Western-blot检测转染重组质粒72h和96h的ERK2蛋白和Survivin蛋白的表达情况;利用流式细胞仪技术测定转染重组质粒96h细胞凋亡和细胞周期分布情况。结果: 1.含10%胎牛血清培养液刺激食管癌细胞p-ERK2的表达随时间的延长逐渐增加;随着U0126浓度的增加使p-ERK2的表达逐渐降低。2.经Pst1酶切和DNA测序分析后,提示ERK2靶向RNA干扰重组载体构建成功。3.荧光倒置显微镜观察转染重组质粒24h细胞开始出现绿色荧光表达,以后随着时间延长绿色荧光表达逐渐增多,72h绿色荧光表达最多,96h略下降。4.MTT检测转染靶向ERK2实验组对食管癌细胞Eca109增殖的抑制率随着时间延长逐渐升高,96h对食管癌细胞增殖的抑制率最高(10.45%),与非特异序列组和空白对照组比较差异显著(P0.05),非特异序列组和空白对照组之间差异无显著性(P0.05)。5.转染靶向ERK2干扰72h和96h实验组对ERK2蛋白和survivin蛋白表达的影响与对照组相比差异显著(P0.05)。6.流式细胞仪测定转染重组质粒96h细胞凋亡率为9.7%,细胞周期阻滞在G1期。结论:1.ERK2蛋白的表达与食管癌细胞Eca109的发生发展相关。2.针对ERK2靶基因的重组质粒成功构建和体外成功转染食管癌细胞Eca109,可抑制该基因的表达和细胞生长。3.ERK2可以通过抑制Survivin蛋白的表达影响食管癌细胞Eca109的生长。4.转染重组质粒抑制食管癌细胞Eca109生长可能有诱导细胞凋亡和影响细胞周期进程两种机制参与。提示质粒介导的RNA干扰技术有望成为治疗食管癌细胞的一种新的手段,为食管癌的基因治疗提供了一条新的思路。
【学位授予单位】:新疆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.1

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【参考文献】
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