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《河北科技师范学院》 2012年
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高产耐热β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株选育及其基因克隆

马腾  
【摘要】:黑曲霉是常见的安全菌株之一,也是普遍公认的产β-葡萄糖苷酶较多的菌株。黑曲霉比其它微生物外源基因表达系统(如细菌,酵母)具有诸多优点,如高分泌性能、高强度启动子、完善的翻译后加工及成熟的发酵工艺等。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, EC.3.2.1.21)是纤维素降解过程中的关键酶之一,但其在自然界中含量少、活力低,是限制纤维素酶解技术发展的瓶颈。因此,通过基因重组技术构建工程菌,利用微生物手段高效表达β-葡萄糖苷酶对纤维素作为生物质能源工业化应用具有重要意义。 本研究从五株黑曲霉中筛选出了产耐热的β-葡萄糖苷酶菌株(黑曲霉3.316)和产β-葡萄糖苷酶活性较高菌株(黑曲霉3.2130),并以这两株菌为研究对象,对黑曲霉高效表达外源β-葡萄糖苷酶基因,做了一些前期基础性工作:发酵工艺条件优化、低酸性蛋白酶活菌株的诱变、β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性研究、β-葡萄糖苷酶基因克隆与序列分析。主要结果如下:(1)响应面分析法优化黑曲霉3.2130产β-葡萄糖苷酶最佳工艺为:麸皮用量17g/L、硫酸铵+蛋白胨用量5g/L(1:1, W/W)、水杨苷+CMC用量3g/L(1:2,W/W)、初始pH5.0、发酵瓶装液量63mL、接种量7mL、摇床转速154r/min,在此条件下发酵,β-葡萄糖苷酶活力达到1.352U/mL,是初始工艺条件产酶的1.23倍。(2)黑曲霉3.2130原生质体经DES诱变,筛选出2株酸性蛋白酶活低的诱变菌株,作为后期基因表达的宿主菌株。(3)黑曲霉3.316发酵粗酶液经分离、纯化得到β-葡萄糖苷酶,经SDS-PAGE电泳测定其亚基分子量为127KDa,反应最适温度和pH值分别为60℃和4.4,该酶于65℃下保温20min,其酶活仍能达到72.6%,属于耐热型酶。(4)利用PCR技术,以黑曲霉3.316总DNA为模板,扩增得到了大小为2934bp的β-葡萄糖苷酶基因,被命名为bgl3.316(GenBank基因序列号为JN969085)。依据目的基因序列对七个外显子进行拼接后得到cDNA序列,并对其核苷酸和氨基酸序列进行了分析,为后期该bgl基因在黑曲霉3.2130中表达奠定了基础。
【学位授予单位】:河北科技师范学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:TQ925

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【参考文献】
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