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《青岛大学》 2014年
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荧光假单胞菌GcM5-1A过氧化物还原酶与黑松的过氧化物酶的基因克隆及其活性研究

刘国华  
【摘要】:过氧化物还原酶家族(Peroxiredoxins, Prxs)是抗氧化酶家族成员,广泛存在于各种生物体内,是一类能降解烷基氢过氧化物和过氧化氢的一类无亚铁血红素过氧化物还原酶。本研究从松材线虫体表的荧光假单胞菌GcM5-1A克隆出一个639bp的完整基因,编码一个由213个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列同源性比对发现,目的蛋白的氨基酸序列分别与Pseudomonas fluorescensQ2-87的硫醇特异性抗氧化蛋白LsfA有99%的同源性,与Pseudomonas sp. GM17的过氧化物还原酶有97%的同源性,与Pseudomonas fluorescens Pf0-1的1-半胱氨酸过氧化物还原酶有97%的同源性。将完整的开放阅读框克隆到表达载体pET-15b,构建重组表达质粒pET-15b-1-Cys-Prx,并转化Escherichia coli BL21(DE3),扩大培养经IPTG诱导表达,利用镍离子琼脂糖凝胶亲和层析纯化得到27kDa的重组蛋白。非变性SDS-PAGE分析发现重组蛋白有部分是以二聚体形式存在的。通过活性分析发现重组蛋白同时具有过氧化物还原酶和硫氧还蛋白活性。研究发现含有重组表达质粒的工程菌明显增强了对过氧化氢压力的耐受性。 另外,本研究采用RT-PCR的方法,从黑松愈伤组织中获得过氧化物酶cDNA,其开放阅读框全长981bp,编码326个氨基酸残基。将该开放阅读框克隆到表达载体pET-15,构建重组表达质粒pET-15b-POD,转化E.coli BL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导工程菌高效表达过氧化物酶,通过Ni2+螯合亲和层析得到了大小约为38kDa重组过氧化物酶。生物信息学分析表明,该蛋白具有植物过氧化物酶的典型结构,以及具有过氧化物酶家族保守的活性位点。活性分析表明该蛋白的确是黑松过氧化物酶,该研究为松萎蔫病抗性机理的研究奠定了基础。
【学位授予单位】:青岛大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S763.3;Q78

【参考文献】
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