NNK联合LPS孵育对小鼠巨噬细胞的增殖及相关基因表达的影响

【摘要】：目的观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、4-(甲基亚硝氨基)-3-吡啶-1-丁酮(NNK)对小鼠巨噬细胞Raw264.7细胞增殖能力及C-myc、NF-κB、i NOS、Arginase、TNFα、IL-1α、IL-6基因表达的影响。方法体外培养小鼠巨噬细胞Raw264.7细胞,用Real time-PCR的方法检测不同浓度的LPS、NNK刺激Raw264.7细胞C-myc m RNA的表达情况,选择药物最佳浓度。利用细胞计数仪对比所选浓度LPS、NNK及LPS联合NNK不同孵育时间对Raw264.7细胞增殖能力的影响;Real time-PCR方法检测C-myc及相关基因m RNA的表达情况;Western Blot技术检测Raw264.7细胞中转录因子C-myc蛋白的表达情况;免疫细胞化学技术检测i NOS蛋白的表达情况;酶联免疫技术定量炎性介质TNF-a及IL-6的含量。结果(1)浓度为10 ng/ml、250ng/ml、1μg/ml和4μg/ml的LPS均可上调Raw264.7细胞的C-myc m RNA的相对表达量;1μg/ml LPS上调作用较其他组显著性增强(P0.05)。浓度为5μM、10μM、25μM和100μM的NNK对Raw264.7细胞的C-myc m RNA表达影响有降低趋势,与对照组相比差异无显著性。(2)选择浓度为1μg/ml LPS+10μM NNK联合孵育Raw264.7细胞,可见24h及36h NNK联合LPS孵育组C-myc m RNA的相对表达量较LPS组显著性降低(P24h0.0001,P36h0.05)。(3)LPS和LPS联合NNK孵育均可降低Raw264.7细胞的增殖活性(P0.05),联合孵育48h的抑制作用较单独LPS孵育略强(P0.05)。(4)LPS孵育24h、36h、48h均可显著刺激Raw264.7细胞NF-κB、Arginase、i NOS m RNA的表达。单独NNK孵育24h、36h、48h可见NF-κB、Arginase、i NOS m RNA相对表达量与对照相比无差异显著性。LPS联合NNK孵育24h、36h NF-κB、Arginase、i NOS m RNA相对表达量升高;其中孵育24h、36h的NF-κB、孵育36h的i NOS m RNA表达量显著高于单独LPS刺激组(P0.05);LPS联合NNK孵育48h,Arginase m RNA表达量也升高,但低于单独LPS刺激组(P0.01)。(5)LPS及LPS联合NNK孵育Raw264.7细胞24h,IL-1a及IL-6 m RNA的表达较对照组明显升高,差异具有显著性(P0.01)。LPS联合NNK组IL-1αm RNA表达量显著高于LPS组(P0.05)。(6)Western Blot结果显示NNK、LPS、LPS联合NNK组孵育24h和48h C-myc蛋白表达量无明显变化。(7)免疫细胞化学结果显示LPS及LPS联合NNK孵育48h,i NOS蛋白表达量明显升高。(8)LPS和LPS联合NNK联合孵育Raw264.7细胞24h、48h,其IL-6、TNF-α蛋白表达均较对照组显著升高,LPS联合NNK孵育48h IL-6蛋白表达量高于LPS组(P0.01),LPS联合NNK孵育24h TNF-α蛋白表量达低于LPS组(P0.05)。结论NNK本身对巨噬细胞的增殖、向M1型转化、转录因子的表达无明显作用。LPS可诱导巨噬细胞C-myc、NF-κB、i NOS、Arginase、IL-1a、IL-6 m RNA的急剧升高,抑制该细胞的增殖、促其向M1型转化。LPS联合NNK联合孵育强化了LPS激活NF-κB、IL-1α等基因作用、弱化了Arginase基因的表达;进一步促进了M1型巨噬细胞的形成和激活,进而刺激M1细胞产生和分泌IL-1α、i NOS等,增加NO的合成;造成正常细胞DNA的损伤增加,阻碍DNA修复,诱导基因突变,刺激肺癌形成。