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《青岛大学》 2017年
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miR-21调控乳腺癌MCF-7细胞STAT3基因的表达

赵守香  
【摘要】:目的:探讨miR-21和信号传导与转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)基因在人乳腺癌MCF-7细胞中的表达,阐明miR-21对STAT3基因的调控作用。方法:培养人乳腺癌MCF-7细胞,接种于25cm2培养瓶内,孵箱中(37℃、5%CO2)培养,每3d换一次液,细胞贴壁达到80%左右,用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化并传代。采用免疫荧光检测STAT3在癌细胞中的表达,取适量细胞涂片,10%甲醛固定后,每张切片滴加20μl 0.1%BSA封闭液封闭1h,以除去非特异性反应。甩去多余液体后,滴加兔抗人STAT3抗体,4℃孵育过夜后,PBS冲洗3次,每次5min,二抗加TRITC标记山羊抗兔Ig G抗体(1:200),37℃孵育30min,PBS冲洗3次,每次5min,DAPI复染细胞核,荧光镜下观察。运用miRNA生物信息学软件miRanda和Target Scan对miR-21和STAT3基因的靶向配对关系进行预测;脂质体2000转染miR-21 mimics进入MCF-7细胞为mimics组,取mimics组以及空白对照组(control)细胞,分别加入Trizol或RNAiso for small RNA提取总RNA,制备1%琼脂糖凝胶,变性电泳检测RNA质量,紫外分光光度计检测总RNA或总miRNA纯度和浓度。应用RNase-free水稀释为1μg/μl,取3μl加入反转录试剂盒体系中反转录为c DNA,稀释后加入SYBR○R Premix Ex Taq?II和引物,跑40个循环的PCR反应,相对表达量用2-△△Ct计算,并对反应结果进行分析。取两组细胞分别加3ml 4℃预冷的PBS洗涤细胞三次,加入RIPA裂解液充分震荡后,超声破碎,采用BCA法测定样品总蛋白量并计算蛋白浓度。根据浓度大小取15μl样品SDS-PAGE电泳分离后转膜,应用4%BSA封闭1 h,加入兔抗人STAT3抗体(1:200),4℃过夜后,TBST洗3次,每次5min,然后滴加二抗(1:800),4℃摇床1 h后,TBST洗3次,每次5min,应用凝胶成像系统和ECL试剂盒发光显影,以β-actin作为内参,检测STAT3蛋白在两组癌细胞中的表达。结果:光镜下见人乳腺癌MCF-7细胞成片生长,有突起;细胞免疫荧光化学发现胞质内有STAT3蛋白的表达,显示红色荧光。生物信息学软件Target Scan显示miR-21在STAT3 m RNA 3’UTR上有一个保守的靶位点,其类型为7mer-m8,匹配得分为95。miRanda结果表明miR-21与靶位点的mir SVR得分为-0.7660,综合两个生物信息学软件预测结果可以看出miR-21与STAT3基因配对良好。RNA电泳显示所提总RNA完整性良好,没有发生严重降解,能够进行后续实验。通过q RT-PCR扩增曲线和熔解曲线发现目的基因和内参基因扩增情况均良好,且引物特异性较好,没有非特异性扩增出现。q RT-PCR检测结果显示mimics组miR-21的表达量是control组的21.08±7.48倍,差异有统计学意义(P0.05);mimics组STAT3m RNA的表达量是control组的49.97±8.62%,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot检测结果显示mimics组STAT3蛋白相对表达量(0.46±0.11)较control组(0.83±0.17)明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。过表达miR-21能够降低STAT3 m RNA和蛋白的表达。结论miR-21能够负性调控人乳腺癌MCF-7细胞中STAT3基因的表达。
【学位授予单位】:青岛大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R737.9

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