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《烟台大学》 2016年
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金纳米材料在酶联免疫分析中的应用研究

李荣超  
【摘要】:酶联免疫分析(ELISA)是以生物酶为标记物的标记免疫分析法,它将抗原-抗体反应的特异性与酶的高效催化放大作用相结合,既保持了酶催化反应的敏感性,又保持了抗原-抗体反应的特异性。但在实际应用中天然酶易变性,不易储存。近年来,由于金纳米颗粒有极高的比表面、独特的生物和光学特性,它被广泛应用于高效免疫分析检测领域。然而,目前利用金纳米颗粒建立的免疫分析法仍然存在着明显的不足,如生物分子的吸附降低了纳米材料模拟酶的催化活性;纳米材料的标记过程复杂等等。本论文着眼解决和改善这些问题,发展了一系列基于金纳米颗粒的光学和生物特性的新酶联免疫分析法,并实现了复杂生物样品中低浓度目标蛋白质的高灵敏度检测。具体工作内容如下:第1章,金纳米材料,以及金纳米材料在酶联免疫分析中的应用。第2章,基于在免疫金表面形成催化铂层,建立了一种新的高灵敏度的比色免疫分析法。首先,使用纳米金颗粒做标记物,通过免疫反应,在聚苯乙烯微孔中形成“三明治”夹心结构;然后,加入铂生长溶液,利用纳米金晶核的催化作用,在免疫金表面形成一层铂层。新生成的铂层会加速H2O2对3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的氧化,生成一种在652 nm处有强吸收的蓝色产物。通过酶标仪、紫外可见分光光度计或肉眼就可实现目标分析物的定量检测。实验结果显示人免疫球蛋白(H-IgG,抗原模型)在0.5到20 ng/mL范围内与652nm处的吸光度呈线性关系。检测限达0.15 ng/mL。与传统的ELISA、电化学金属免疫法和荧光免疫法等相比,这种免疫分析法更灵敏。此外,通过肉眼观察颜色变化,可实现低至0.5 ng/mL H-IgG的半定量检测。同时,我们将这种方法应用于实际样品中的H-IgG和人甲胎蛋白(一种肿瘤标志物)的检测,结果显示所提出的方法具有良好的专一性与抗干扰能力,可望用于临床诊断。第3章,基于碱性磷酸酶催化产物间接刻蚀金纳米棒,提出了一种新的等离子体ELISA。通过经典的夹心免疫过程将碱性磷酸酶(ALP)标记的抗体捕捉到聚苯乙烯微孔中。ALP催化磷酸抗坏血酸酯水解,生成抗坏血酸。抗坏血酸将碘酸离子还原为碘单质。碘单质刻蚀金纳米棒,使之由棒状变为球形。金纳米棒形貌的改变导致了其纵向等离子共振吸收峰蓝移,同时金纳米棒溶液由蓝色变红色。依据这一原理,建立了新的等离子体ELISA。用酶标仪的检测限低至100 pg/mL H-IgG;目视检测限为3.0 ng/mL。通过检测胎牛血清中的H-IgG,验证了新方法可用于临床诊断。第4章,基于辣根过氧化物酶催化产生可刻蚀金纳米棒的试剂,探索了一种新的等离子体ELISA。辣根过氧化物酶催化H2O2与对碘苯酚反应,生成的碘单质将金纳米棒刻蚀。使得金纳米棒形貌发生变化,并使其纵向局部等离子体共振吸收峰蓝移。利用这一现象,开发了一种新的等离子体ELISA。利用正交试验优化检测条件后,对H-IgG检测限为5 ng/mL。而且此方法具有良好的抗干扰能力,通过检测加标的胎牛血清样品,回收率达89.9%~106%。
【关键词】:金纳米材料 酶联免疫分析法 碱性磷酸酶 辣根过氧化物酶
【学位授予单位】:烟台大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R446.6;O614.123;TB383.1
【目录】:
  • 摘要3-5
  • Abstract5-10
  • 1 绪论10-26
  • 1.1 酶联免疫吸附测定法(ELISA)的概要10-11
  • 1.1.1 ELISA的概念10
  • 1.1.2 ELISA的原理10-11
  • 1.2 金纳米材料的性质11-18
  • 1.2.1 金纳米材料的模拟酶性质11-14
  • 1.2.1.1 模拟酶11-13
  • 1.2.1.2 金纳米颗粒的模拟酶性质13-14
  • 1.2.2 金纳米材料的局域表面等离子体共振效应(LSPR)14-18
  • 1.2.2.1 LSPR的原理14-15
  • 1.2.2.2 球形金纳米颗粒LSPR的影响因素15-16
  • 1.2.2.3 金纳米棒LSPR的影响因素16-18
  • 1.3 金纳米材料在ELISA中的应用18-24
  • 1.3.1 金纳米材料的模拟酶活性在ELISA的应用18-21
  • 1.3.2 金纳米材料的LSPR在ELISA的应用21-23
  • 1.3.2.1 基于纳米颗粒聚集的ELISA21-22
  • 1.3.2.2 基于纳米材料形貌改变的ELISA22-23
  • 1.3.3 金纳米材料在ELISA的其他应用23-24
  • 1.4 本课题的研究意义24-26
  • 2 基于在免疫金上形成催化铂层的比色免疫分析法26-40
  • 2.1 前言26-27
  • 2.2 实验部分27-29
  • 2.2.1 试剂与仪器27-28
  • 2.2.2 AuNPs-G-HIgG的制备28
  • 2.2.3 AuNPs-M-AFP的制备28
  • 2.2.4 人免疫球蛋白(H-IgG)的比色免疫分析28-29
  • 2.2.5 生物样品中H-IgG的比色免疫分析29
  • 2.2.6 甲胎蛋白的比色免疫分析29
  • 2.2.7 人血清中甲胎蛋白的比色免疫分析29
  • 2.3 结果与讨论29-38
  • 2.3.1 比色免疫分析法的原理29-32
  • 2.3.2 灵敏度和线性关系32-36
  • 2.3.3 特异性36-37
  • 2.3.4 实际生物样品的分析37-38
  • 2.4 小结38-40
  • 3 基于碱性磷酸酶催化产物间接刻蚀金纳米棒的比色免疫分析法40-56
  • 3.1 前言40-41
  • 3.2 实验部分41-43
  • 3.2.1 试剂和仪器41
  • 3.2.2 金纳米棒的合成41-42
  • 3.2.3 抗坏血酸的检测42
  • 3.2.4 碱性磷酸酶(ALP)的检测42
  • 3.2.5 免疫分析42-43
  • 3.2.6 生物样品中H-IgG的检测43
  • 3.3 结果与讨论43-55
  • 3.3.1 碘刻蚀Au NRs的原理43-46
  • 3.3.2 基于碘刻蚀Au NRs还原性物质的检测46-48
  • 3.3.3 ALP的比色检测48-52
  • 3.3.4 可视化Plasmonic ELISA52-54
  • 3.3.5 胎牛血清中H-IgG的检测54-55
  • 3.4 小结55-56
  • 4 基于辣根过氧化物酶催化产物刻蚀金纳米棒的ELISA56-66
  • 4.1 前言56-57
  • 4.2 实验部分57-58
  • 4.2.1 试剂与仪器57
  • 4.2.2 金纳米棒的制备57-58
  • 4.2.3 辣根过氧化物酶(HRP)的检测58
  • 4.2.4 免疫分析58
  • 4.3 结果与讨论58-65
  • 4.3.1 检测原理58-59
  • 4.3.2 HRP检测条件的优化59-62
  • 4.3.3 HRP检测62-63
  • 4.3.4 基于HRP检测的免疫分析63-65
  • 4.4 小结65-66
  • 5 结论与展望66-68
  • 5.1 结论66
  • 5.2 展望66-68
  • 参考文献68-82
  • 致谢82-84
  • 作者简介84-86
  • 攻读学位期间发表的学术论文86-87

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