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《烟台大学》 2019年
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盐酸右美托咪啶毒性和镇静作用受体机制研究

王震  
【摘要】:目的:研究盐酸右美拖咪啶(dexmetomidine hydrochloride,DMED)发挥毒性作用的主要受体类型及受体后关键分子通路,明确盐酸右美托咪啶毒性与镇静作用的不同机制。研究内容:1.α_(2B)-AR或α_1-AR拮抗剂对DMED镇静作用的影响:采用小鼠翻正反射模型,研究不同α_(2B)-AR或α_1-AR拮抗剂对DMED引起小鼠翻正反射消失的作用。2.α_2-AR或α_1-AR拮抗剂对DMED毒性作用的影响:提前给予不同的α_2-AR或α_1-AR拮抗剂,研究其能否降低DMED的致死率。3.DMED激活α_(2B)-AR受体后信号通路的研究:建立共表达α_(2B)-AR和增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子c1(EGFP-NFATc1)的U2OS细胞株,根据N FATc1核转位评价不同化合物对α_(2B)-AR的激动或抑制作用。建立共表达α_(2B)-AR受体和增强型绿色荧光蛋白标记的蛋白激酶A催化亚基(PKAcat-EGFP)的CHO细胞株,以PKA重分布实验评价不同化合物激活或者拮抗α_(2B)-AR后对AC-cAMP-PKA信号通路的影响。4.DMED镇静及毒性作用的受体后机制的研究:评价Gαi/o抑制剂PTX、Gαq/11抑制剂YM-254890、PLC抑制剂U73122、胞内Ca~(2+)螯合剂BAPTA和L-Ca~(2+)阻滞剂维拉帕米(verapamil)和尼莫地平(nimodipine)对DMED毒性效应的作用;PT X及YM-254890对DMED镇静效应的作用;并观察PTX及YM-254890对α_(2B)-AR信号通路的影响。研究方法:1.Prazosin、HEAT和imiloxan分别给药后15 min,给予DMED,观察小鼠翻正反射消失率、翻正反射消失的诱导时间和制动时间,评价不同拮抗剂对DMED镇静作用的影响。2.α_2-AR或α_1-AR拮抗剂预先给药15 min后,给予DMED,记录大鼠、小鼠连续7天的死亡情况,以第1天死亡率和连续7天内的死亡率为指标评价各拮抗剂的抗致死作用。取小鼠肺组织进行HE染色,观察小鼠的肺组织损伤。3.将α_(2B)-AR的重组质粒(pcDNA3.1-Hygro-α_(2B)-AR)转染至表达带有增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子c1(NFATc1)的U2OS细胞(U2OS-EGFP-N FATc1-α_(2B)-AR),以及表达带有增强型绿色荧光蛋白的蛋白激酶A催化亚基(PKA cat)的CHO细胞(CHO-PKAcat-EGFP-α_(2B)-AR),分别通过NFATc1核转位实验筛选U2OS-EGFP-NFATc1-α_(2B)-AR稳转细胞株,采用PKA重分布实验筛选CHO-PKAc at-EGFP-α_(2B)-AR稳转细胞株。以U2OS-EGFP-NFATc1-α_(2B)-AR细胞为工具细胞,评价α_2-AR激动剂DMED对NFATc1核转位的作用;α_2-AR拮抗剂盐酸阿替美唑(ati pamezole,ATI)、α_(2A)-AR拮抗剂BRL44408,α_(1/2B)-AR拮抗剂盐酸哌唑嗪(prazosin)、α_(2B)-AR选择性拮抗剂ARC239和imiloxan,与DMED(10~(-7)M)共孵育,评价拮抗剂对DMED作用的对抗。以CHO-PKAcat-EGFP-α_(2B)-AR细胞为工具细胞,评价α_2-AR激动剂DMED、可乐定、胍法辛对PKA重分布的作用;α_2-AR拮抗剂咪唑克生、ATI与DMED(10~(-7)M)共孵育后,评价拮抗剂对DMED作用的对抗。4.Gαq/11抑制剂YM-254890给药后30 min,Gαi/o抑制剂PTX(0.25μg,i.c.v)给药后4天,尾静脉注射镇静或致死剂量的DMED,观察对动物镇静或死亡的影响。以U2OS-EGFP-NFATc1-α_(2B)-AR和CHO-PKAcat-EGFP-α_(2B)-AR稳定转染细胞株为工具细胞,YM-254890或PTX与DMED共孵育后,评价YM-254890或PTX对D MED引起NFATc1核转位以及PKA重分布的影响;U73122、BAPTA、维拉帕米或尼莫地平给药后15 min,尾静脉注射致死剂量的DMED,观察对动物死亡的影响。研究结果:1.α_1-AR或α_(2B)-AR拮抗剂对DMED镇静作用的影响:Prazosin、HEAT和imil oxan预先给药后,对DMED引起的小鼠翻正反射消失没有影响。2.α_2-AR或α_1-AR拮抗剂对DMED毒性作用的影响。2.1不同受体拮抗剂对DMED引起小鼠死亡的影响:ATI没有抗致死作用;AR C239能够显著降低DMED(25.6 mg/kg)给药后,小鼠在1天和连续7天的死亡率;Prazosin、HEAT、BRL44408和JP1302不同程度的降低DMED给药后,小鼠在第1天内的死亡率,对小鼠7天的死亡率没有影响。2.2不同受体拮抗剂对DMED引起大鼠死亡的影响:Prazosin、HEAT和ARC239能够不同程度的降低DMED(8 mg/kg,i.p)给药后,大鼠在1天和连续7天的死亡率,ATI只能够降低DMED(8 mg/kg,i.p)给药后,大鼠在连续7天的死亡率;Prazosin显著降低DMED(8 mg/kg,i.v)给药后,大鼠在1天和连续7天的死亡率,ATI没有抗致死作用;Prazosin能够完全对抗DMED(8、16 mg/kg/mL,i.v,0.02mL/min)致死作用,ATI能够完全对抗DMED(8、16 mg/kg/mL,i.v,0.02 mL/mi n)给药后,大鼠在1天内的死亡率,明显降低连续7天内大鼠的死亡率。2.3 DMED静脉注射后对小鼠肺组织的损伤:小鼠缓慢尾静脉注射DMED(25.6 mg/kg)后,小鼠肺部明显淤血,肺组织HE染色发现明显的肺部血管淤血,肺泡破裂并涌入大量的红细胞。3.DMED激活α_(2B)-AR受体后信号通路的研究3.1α_(2B)-AR稳转细胞株的建立:成功构建了α_(2B)-AR稳定表达且功能较好的U2O S-EGFP-NFATc1-α_(2B)-AR细胞株以及CHO-PKAcat-EGFP-α_(2B)-AR细胞株。3.2 DMED激活α_(2B)-AR后对NFATc1信号通路的作用:DMED激活α_(2B)-AR后,可以浓度依赖的提高细胞NFATc1的相对核转位水平,其EC_(50)值为(2.62±0.07)n M;ATI、ARC239、imiloxan、prazosin、BRL44408可以浓度依赖性对抗DMED(10~-77 M)的作用,IC_(50)值分别为(89.05±0.13)、(11.13±33.53)、(103.50±2.35)、(493.40±0.25)和(931±0.21)nM。α_2-AR拮抗剂的作用强度分别为:ARC239?ATI?imiloxan?prazosin?BRL44408。3.3 DMED激活α_(2B)-AR后对AC-PKA-PKA信号通路的作用:DMED、可乐定和胍法辛能够激活α_(2B)-AR后,抑制AC-cAMP-PKA相关信号通路,逆转由AC激活剂foskorlin所致的PKA弥散性分布,浓度依赖的提高PKA颗粒聚集程度,EC_(50)值分别为(1.15±0.11)nM、(11.0±0.44)nM和(58.5±0.08)nM。ATI和咪唑克生可以浓度依赖性对抗DMED(10~(-7)M)的作用,IC_(50)分别为(565.6±0.21)nM和(5.53±0.04)μM。4.DMED镇静及毒性作用的受体后机制的研究4.1 Gαq/11抑制剂YM-254890对DMED毒性及镇静作用的影响:YM-254890对DMED引起的动物死亡无明显作用,且不能对抗DMED的镇静作用。4.2 Gαi/o抑制剂PTX对DMED毒性及镇静作用的影响:PTX(0.25μg,i.c.v)预先给药4天可以完全抑制DMED(0.17 mg/kg,i.v)诱导的小鼠翻正反射消失,但对DMED(25.6mg/kg,i.v)致死率的降低作用并不明显,PTX能够对抗DMED的镇静作用,不能对抗DMED的毒性作用。4.3 YM-254890对DMED激活α_(2B)-AR后信号通路的影响:Gq/11抑制剂YM-254890可以浓度依赖性降低DMED(10~(-7)M)导致的NFATc1核转位,IC_(50)值为(103.50±2.34)nM。4.4 Gαi/o抑制剂PTX对DMED激活α_(2B)-AR后信号通路的影响:PTX对DMED促进NFATc1核转位的作用没有影响。4.5 U73122、BAPTA、维拉帕米和尼莫地平对DMED毒性作用的影响:U73122无抗致死作用;BAPTA、维拉帕米和尼莫地平具有明显抗致死作用。研究结论:1.α_1-AR或α_(2B)-AR不参与DMED的镇静作用。2.高剂量DMED的致死作用可能主要是由于DMED激动α_(2B)-AR和α_1-AR引起的;DMED的致死作用可能与其引起的肺淤血有关。3.Gαi/o信号通路是DMED产生镇静作用激活的关键信号通路;DMED作用于α_(2B)-AR,引起胞内Ca~(2+)浓度升高,导致大小鼠的死亡。创新点:DMED致死作用受体主要是α_(2B)-AR和α_1-AR,而不是α_(2A)-AR和α_(2C)-AR,表明D MED的致死作用与镇静作用受体机制相分离,有利于指导毒性作用小的高选择性镇静药的筛选。
【学位授予单位】:烟台大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R965

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