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20(S)-原人参二醇型皂苷诱导HGC-27细胞死亡的自噬相关机制研究

韩晴晴  
【摘要】:背景:胃癌是消化系统最常见肿瘤之一,其死亡率高居全球癌症相关死亡第三位,化疗仍是目前最常用的治疗手段,但受其副作用与耐药性的影响,治疗效果不甚理想。近年来,20(S)-原人参二醇型皂苷因其良好的体内及体外抗肿瘤活性而备受关注,其作用方式涉及调控细胞周期、诱导细胞凋亡、干预细胞自噬等,但其确切机制及构效关系还有待于进一步研究。目的:本论文以人胃癌细胞HGC-27为研究对象,考察20(S)-原人参二醇型皂苷Rg3、Rh2及PPD的体外抗肿瘤活性与差异,拟通过对细胞凋亡、细胞自噬、线粒体与溶酶体功能等的相关检测与研究,探讨其抗肿瘤作用机制,为其进一步应用和胃癌的治疗提供可靠实验依据。方法:本论文以HGC-27细胞为实验对象,开展完成以下实验:(1)磺酰罗丹明B(SRB)法检测肿瘤细胞存活率;(2)Giemsa染色法观察细胞形态变化及胞质空泡的形成;(3)TUNEL染色法检测细胞凋亡;(4)Western Blot检测凋亡相关蛋白caspase3、自噬相关蛋白LC3与p62;(5)激光共聚焦显微镜免疫荧光共定位检测溶酶体膜完整性与pH变化;(6)高相液相色谱法(HPLC)检测胞内ATP、ADP、AMP含量并分析细胞能荷状态;(7)MitosoxTM Red荧光探针染色,流式细胞术检测线粒体活性氧;(8)JC-1探针染色,荧光显微镜检测线粒体膜电位;(9)透射电子显微镜(TEM)观察细胞器及自噬小体等亚结构。结果:通过以上实验检测和分析,得到如下结果:(1)20(S)-原人参二醇型皂苷Rg3、Rh2及PPD均有抑制人胃癌HGC-27细胞增殖的作用,其中Rh2细胞毒作用最强(IC50=4.93±0.19 μM),PPD次之(IC50=6.25±0.64 μM),Rg3 最弱(IC50=33.31±6.91 μM);当处理浓度为9 μM时,Rh2与PPD处理HGC-27细胞6h,可诱导细胞出现明显胞质空泡化现象,与对照组相比,空泡率差异具有统计学意义(p0.01),而Rg3组未发现类似现象;(2)TUNEL染色检测表明三种原人参二醇型皂苷均未诱导典型的细胞凋亡,同时未出现明显cleaved caspase-3的表达,广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk对三种人参皂苷所致的细胞死亡无明显改善作用,凋亡并非主要的细胞死亡方式;(3)Rh2与PPD均可诱导HGC-27细胞内LCⅡ蛋白上调,与对照组相比,差异具有统计学意义(p0.01),而且在Rh2处理组中,p62蛋白显著积累(p0.05);而Rg3处理组LCⅡ与p62蛋白均无明显变化;(4)Rh2与PPD处理组中,细胞内半乳糖凝集素3(Ga13)与溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)荧光共定位,表明Rh2与PPD可诱导HGC-27细胞溶酶体膜破裂;Rg3、Rh2及PPD均可诱导细胞酸性囊泡pH上升与溶酶体内pH上升,但Rg3组无统计学差异,Rh2、PPD组差异显著(p0.05);(5)溶酶体H+-ATP抑制剂BafA1可加重Rh2与PPD诱导的胞质空泡率,差异具有统计学意义(p0.05);同时,BafA1可显著加重Rh2与PPD诱导的细胞毒作用(p0.01);(6)Rh2均与PPD可诱导线粒体功能代谢紊乱,ATP含量显著下降(p0.01);Rg3、Rh2及PPD可不同程度降低线粒体能荷,仅Rh2处理组具统计学差异(p0.05);(7)Rh2与PPD可诱导线粒体活性氧持续性爆发;Rg3、Rh2及PPD均可诱导线粒体膜电位不同程度下降,Rg3组无显著性差异,Rh2、PPD组差异具有统计学意义(p0.01);(8)电子透射显微镜检测结果显示,Rh2与PPD可诱导HGC-27细胞线粒体与溶酶体结构受损,胞质内受损细胞器与自噬结构异常溶胀、堆积。结论:20(S)-原人参二醇型皂苷Rg3、Rh2及PPD对HGC-27细胞均有一定的细胞毒作用;Rh2与PPD可诱导细胞胞质空泡化死亡,凋亡在该过程中并不占主导地位,而与自噬流调控密切相关。其可能的作用机制如下:Rh2与PPD诱导线粒体ATP生成减少,能荷降低,ROS爆发,进而导致溶酶体膜完整性受损、pH上升,并释放酸性水解酶进一步损伤线粒体等细胞器;溶酶体功能障碍使自噬通路受阻,受损细胞器无法修复与降解,导致受损细胞器与自噬结构在胞质中积累、溶胀,最终诱导细胞呈胞质空泡化死亡。人参皂苷C-3位上糖数量与其体外抗癌活性呈负相关,Rh2(1个糖)和PPD(无糖)比Rg3(两个糖)具有更强的体外抗肿瘤活性。


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