藻蓝胆素的制备及其作为光敏剂的初步研究

【摘要】：藻蓝胆素(Phycocyanobilin,PCB)是蓝藻、红藻及部分隐藻中的一种线性四吡咯结构的天然色素,具有特殊的光学性质及良好的抗氧化活性,在光能的吸收和传递、抑制氧化损伤及光遗传学等方面发挥着重要的作用,在作为光敏剂的开发方面具有可观的前景。在天然藻类中,存在着PCB、叶绿素、叶黄素等多种光合色素。其他光合色素的存在使得从藻类中分离纯化PCB的工艺变得复杂。本文研究了两种PCB的制备方法:一种是通过重组大肠杆菌发酵制备PCB,另一种是从藻类天然产物藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)中提取PCB,并对两种PCB产物进行了光谱性质的比较。其次,对PCB作为光敏剂用于光动力治疗的可能性进行了初步的验证。结论如下:(1)本文使用重组质粒pET-28a-hox1-pcyA构建并筛选出一株能够稳定表达PCB的重组大肠杆菌“EP-1”,并分别通过响应面优化、液相-质谱联用(LC-MS)及光谱分析的方法来提高重组表达PCB的产量及分析制备的PCB的纯度及光谱性质。结果显示:当发酵液培养4.6 h时,加入4 mmol/L的乳糖作为诱导剂,25℃诱导表达13.6 h后,发酵液中PCB的浓度约为13 mg/L,与文献相比,PCB在发酵液中的浓度提高了3倍左右;制备的PCB的纯度约为70%左右;重组表达的PCB在酸性条件下会发生质子化,吸收光谱由600 nm左右红移到680 nm左右。(2)本文通过高温乙醇裂解PC和真空冷冻干燥固化的组合方法从PC中提取天然PCB,利用LC-MS及光谱分析的方法对天然PCB的纯度及光谱活性进行分析鉴定,并对天然PCB与重组PCB的吸收和荧光光谱性质进行对比分析。结果显示:当使用150 mL浓度为70%的乙醇作为PC的裂解液,78℃裂解18 h后可使天然PCB的产量达160 mg/10 g PC;提取到的天然PCB的纯度约为62%左右;重组表达的PCB具有与天然PCB相同的吸收和荧光光谱性质。(3)运用从PC中提取到的天然PCB作为实验材料,借助荧光共聚焦显微镜观察PCB被小鼠单核巨噬细胞J774A.1及人肝癌细胞HepG2的摄取情况。随后,将PCB作为光敏剂,验证PCB在600 nm激发光源下对HepG2及J774A.1的光动力杀伤作用。实验结果表明:PCB可以被J774A.1及HepG2摄取,当使用150 mW/cm~2的600 nm光源下照射1.5 h后,250μg/mL PCB可以导致HepG2及J774A.1的细胞活力基本完全丧失。PCB有望被发展成为一种新型的光敏剂,用于肿瘤的光动力治疗中。