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《成都大学》 2020年
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生赤壳霉Fataf6多糖对苦荞芽营养功能品质的影响

江兰  
【摘要】:苦荞(Tartary buckwheat)是一种著名的食药同源特色小宗杂粮作物。由苦荞种子萌发而成的苦荞芽是一种新型芽苗类蔬菜,营养丰富,经济价值高,且富含芦丁、槲皮素等黄酮类活性成分,具有很好的开发利用价值和市场前景。众多研究表明,内生真菌多糖类物质能有效促进宿主植物中活性次生代谢产物的合成与积累。本论文通过发酵培养、提取制备和分离纯化等方法得到苦荞内生真菌生赤壳霉(Bionectria piyrodes,Fataf6)胞外多糖和胞内多糖;进一步研究其对苦荞芽生长和黄酮类物质合成积累的影响规律与初步作用机制,并对苦荞芽的品质进行分析评价,以期为高品质苦荞芽菜的深入开发利用提供依据,主要研究结果如下:1、内生真菌Fataf6粗多糖的制备及其对苦荞芽生长和黄酮含量的影响。通过水提醇沉法获得内生真菌Fataf6胞外多糖(EPS)、菌丝水提多糖(WPS)和碱提多糖(SPS)3种粗多糖。其中,EPS得率为0.5475 mg/mL,WPS和SPS得率分别为4.80%和1.76%。活性初筛结果发现3种粗多糖对苦荞芽生长及黄酮积累具有一定的促进作用,其中以EPS的促进效果最为明显,WPS的诱导效果次之。当EPS诱导浓度为200μg/mL时,苦荞芽主要黄酮类物质(荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁和槲皮素)的含量增至0.21 mg/g、0.27 mg/g、1.37 mg/g、1.76 mg/g、54.52 mg/g和1.36 mg/g,较对照分别提高了40.00%、42.11%、85.14%、37.50%、35.05%和115.87%。2、内生真菌Fataf6活性多糖的分离纯化及理化特征初步分析。采用DEAE-52纤维素阴离子柱层析方法分别对EPS和WPS进行分离纯化,共获得3个主要多糖EPS-I、WPS-I和WPS-II。通过凝胶渗透色谱法(GPC)对活性多糖的分子量分布进行测定,得到EPS-I的数均分子量(Mn)为1.449×10~4,重均分子量(Mw)为5.152×10~4;WPS-I的Mn为3.463×10~4,Mw为6.248×10~4;WPS-II的Mn为4.049×10~4,Mw为9.643×10~4;进一步采用高效液相色谱法(HPLC)和傅里叶红外光谱法(FTIR)对其单糖组成和结构特征进行了初步分析,结果表明3种活性多糖主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成。3、内生真菌Fataf6活性多糖对苦荞芽生长及黄酮合成积累的影响。通过研究不同浓度的EPS-I、WPS-I和WPS-II对苦荞芽生长和黄酮积累的影响,发现其对苦荞种子发芽率、发芽势、芽长、生物量和黄酮类物质合成具有较好的促进作用,其诱导效应与多糖的类型和处理浓度紧密相关,且与粗多糖的促进效果基本保持一致,表明分离纯化得到的多糖(EPS-I、WPS-I和WPS-II)即为内生真菌Fataf6对应粗多糖的有效组分。3种活性多糖的最佳诱导浓度分别为EPS-I(150μg/mL)、WPS-I(50μg/mL)和WPS-II(100μg/mL),且EPS-I的促进作用最为显著。当EPS-I的处理浓度为150μg/mL时,苦荞发芽率为95.33%、芽长为8.98 cm、鲜重为11.06 g/100株、干重为0.8172 g/100株,分别较对照提高了4.76%、25.77%、39.82%和7.89%;苦荞芽中主要黄酮类物质荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁和槲皮素分别为0.18 mg/g、0.32 mg/g、1.03 mg/g、1.51 mg/g、49.09 mg/g和1.23 mg/g,分别较对照提高了20.00%、68.42%、39.19%、17.97%、21.57%和95.23%。4、内生真菌Fataf6多糖诱导苦荞黄酮合成积累的初步作用机制。通过研究苦荞芽经活性多糖EPS-I(150μg/mL)、WPS-I(50μg/mL)和WPS-II(100μg/mL)处理后,其诱导周期内苦荞芽中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性、苦荞芽培养液中pH值与电导率,以及黄酮积累量等指标的变化,以揭示内生真菌多糖诱导苦荞黄酮合成积累的初步作用机制。研究发现,当EPS-I浓度为150μg/mL时,苦荞芽中PAL活性在6 h、36 h达到峰值81.75 U/g和87.00 U/g,分别为对照的1.47倍和1.56倍;苦荞芽中PPO和SOD活性分别在6 h及36 h时增至23.33 U/g与7348.45 U/g,为对照的1.94倍和1.32倍。EPS-I和WPS-II诱导处理能使苦荞芽培养液的pH值降低,在48 h时,其pH达到最低值5.08和5.18,分别较对照降低了11.81%和10.07%。3种多糖均能降低苦荞芽培养液的电导率,经EPS-I、WPS-I和WPS-II处理96 h后,苦荞芽培养液电导率与对照相比分别降低了58.73%、60.75%和81.38%。活性多糖处理后,苦荞芽中主要黄酮类物质含量变化趋势与对照基本一致,但其增加幅度较对照更为明显。EPS-I诱导处理0-36 h内,苦荞芽主要黄酮类物质的增加量为30.43 mg/g,而对照的增加量为25.49 mg/g。相关结果初步表明内生真菌Fataf6多糖能够激发苦荞芽的防御反应,诱导信号通过信使分子逐级传递和放大,从而引起胞内某些特定功能基因的表达,关键酶的激活,进而促进苦荞芽中主要黄酮类次生代谢产物的合成积累。5、活性多糖诱导处理后苦荞芽的品质分析。选用3种适宜浓度的活性多糖对苦荞芽进行诱导处理,进一步对苦荞芽脂肪、可溶性糖、可溶性蛋白质、叶绿素和类胡萝卜素、氨基酸,以及生物黄酮等主要营养功能成分进行分析测定。研究结果发现多糖诱导能增加苦荞芽中可溶性糖、可溶性蛋白和总黄酮的含量,其中以EPS-I的促进效果最为明显,当其处理浓度为150μg/mL时,苦荞芽中可溶性糖、可溶性蛋白和总黄酮含量分别为190.29 mg/g、4.11 mg/g和58.98 mg/g,较对照相比分别提高了5.13%、11.18%和21.40%。多糖对苦荞芽中叶绿素及类胡萝卜素的合成具有轻微的抑制作用,而对脂肪含量无显著影响。多糖诱导后的苦荞芽与对照相比,其氨基酸组成和含量基本一致,且都含有亮氨酸、赖氨酸和缬氨酸等7种人体必需氨基酸。本研究结果为高品质苦荞芽菜的生产与开发利用提供了一条新途径,同时也为深入探讨内生真菌调控宿主活性成分合成积累的作用机制提供一定科学依据,将有助于促进我国荞麦产业的快速发展。
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