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《扬州大学》 2011年
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肠出血性大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及胶体金免疫层析试纸条的研制

孟祥升  
【摘要】:肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)0157:H7是一种重要的食源性病原菌,1982年该菌首先在美国被发现,此后在世界各地散发或地方流行。该菌感染可引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)、血栓性血.小板减少性紫癜(TTP)等全身性并发症。 反刍动物是EHEC O157:H7的三要贮存宿主,国内外均有从牛羊等动物的粪便中分离到该菌的报道,目前普遍认为受污染的环境、食物和水源是本病的主要传播媒介。建立和完善动物性食品及环境中EHEC O157:H7的检测手段,是进行流行病学调查以及该病防控的关键问题之一。虽然分离培养鉴定仍是检测EHEC0157:H7的金标准,但通常需要数天才能得到结果,不能满足快速诊断的需要。分子生物学和免疫学方法因具有特异、敏感、快速等特点在EHEC O157:H7检测和诊断中发挥着愈来愈重要的作用。 研究一:将E. coli0157:H7用甲醛灭活,免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了5株能稳定分泌抗E. coli0157:H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为181、2D6、2D9、2E3和2G5。其中2G5的Ig亚类为IgG3,其余四株均为IgM,轻链均为K型,腹水抗体ELISA效价分别为1×105、1×104、1×106、1×107、1×107,凝集试验显示五株单抗与EHEC O26:H11、 EHEC O111等其他受试菌株均不反应,具有良好的特异性。 研究二:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,用纯化的单克隆抗体2G5标记,制备金标抗体玻璃纤维素膜;将纯化的2E3固定于硝酸纤维素膜(NC)上作为捕获抗体;组装成双抗夹心法O157:H7胶体金免疫层析检测试纸条。用该试纸条可特异检测O157:H7,敏感度为106CFU/ml,在1~5min内可得出检测结果,与EHECO26:H11、EHEC O111等其他受试菌株均不反应;敏感性高,特异性强,便于O157:H7的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。 研究三:采用灌胃攻毒方式,使小鼠感染O157:H7,用大肠杆菌157检测试纸条与O157:H7鉴别培养基细菌培养计数两种方法检测感染小鼠粪便中的O157:H7的排菌量和排菌持续时间。结果显示小鼠在感染O157:H7后2h开始粪便排菌,6h达到峰值,排菌时间最长可持续15d。大肠杆菌O157检测试纸条与O157:H7鉴别培养基细菌培养计数两种方法的检测结果一致,试纸条更简便、快捷、直观,在1~5min内可得出检测结果,便于O157:H7临床样品的快速检测以及粪便、食品、环境污染物、水样等现场检测样品中O157:H7的快速筛查。本实验为O157:H7流行病学、致病机理和防控研究提供了动物模型和检测手段。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S852.61

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