鸡源高迁移率族蛋白B1与J亚群禽白血病病毒复制关系的研究

【摘要】：高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein box1protein, HMGB1)是1973年从小牛胸腺中发现的一类广泛存在于真核生物细胞中高度保守的非组蛋白核蛋白。HMGB1在生理状态下发挥着核结合蛋白的作用,当HMGB1进入细胞间隙时,则表现出晚期炎症因子的作用,参与炎症反应。新近研究发现HMGB1不仅是一种转录和促生长因子,也是一种重要的炎性细胞因子,并与肿瘤的发生、浸润、转移等生物学行为关系密切。 禽白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称,该病毒在临床能引起多种类型的肿瘤。从鸡体中分离的ALV可以分为6个亚群(A-E,J),其中J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是外源性禽白血病病毒中的一种。ALV-J主要引起临床肉用型和蛋用型鸡发生髓细胞瘤、淋巴细胞瘤、血管瘤等多种类型的肿瘤,同时ALV-J感染还会引起蛋鸡产蛋率的迅速下降,死淘率的上升,严重影响养禽业的健康发展。 本实验室在前期蛋白质组学研究中发现,鸡源高迁移率族蛋白B1(chicken high mobility group protein B1, chHMGB1)在ALV-J感染DF1细胞中有明显变化。结合以往的文献报道和前期的实验结果推测chHMGB1可能在ALV-J感染过程中发挥一定的作用。研究chHMGB1与ALV-J复制的关系,从而揭示chHMGB1在ALV-J感染过程中的作用,有利于全面了解ALV-J的致肿瘤机制,也可为ALV-J的治疗和防御提供理论依据。 1.鸡源高迁移率族蛋白B1基因Real-time PCR检测方法的建立与应用 为了检测chHMGB1基因在ALV-J感染过程中的变化,本研究根据家禽鸡源高迁移率族蛋白B1全长序列设计特异性的chHMGB1荧光定量PCR引物,扩增出chHMGB1基因片段,将目的基因与pGEM-T载体进行连接,构建chHMGB1基因的载体质粒作为标准品,将鉴定正确的chHMGB1基因的T载体质粒进行10倍梯度稀释,用Real-time PCR方法扩增chHMGB1基因标准曲线,建立绝对定量Real-time PCR方法。并利用建立的方法检测一日龄雏鸡体内组织脏器以及实验室常用禽源细胞中chHMGB1基因的正常表达水平,从而为进一步研究鸡源高迁移率族蛋白B1在家禽疾病免疫调节和炎症过程中的生物学作用提供了一种快速、可靠的检测方法。 2. ALV-J感染细胞与组织脏器中chHMGB1与病毒基因的动态变化 ALV-J感染禽源CEF、DF1和HD11细胞,利用荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western Blot实验检测感染过程中chHMGB1与病毒基因和蛋白水平的动态表达情况。荧光定量PCR结果显示,随着感染时间增加,不同禽源细胞中ALV-J复制明显。在病毒感染过程中,DF1细胞中的chHMGB1基因呈现出1h上调,6h下调,12h上调,24h、48h及72h处于下调状态,于96h再次上调：CEF细胞中的chHMGB1基因在1h上调,6h下调,12h、24h、4h、72h及96h均呈现上调；HD11细胞中1h与6h处于下调状态,12h呈现上调,24h和48h基因下调,72h和96基因上调。间接免疫荧光结果显示,随着感染时间增加,病毒荧光逐渐增强,但同时也发现在不同细胞中,chHMGB1蛋白仍位于胞核中,未因病毒感染而发生蛋白迁移变化。Western Blot检测细胞中chHMGB1含量结果,与荧光定量PCR检测结果基本一致。 ALV-J感染SPF鸡1、28、56、84、112和140日龄肾脏和肝脏组织中的Real-time PCR检测结果表明,在肾脏中chHMGB1与病毒基因的变化趋势基本一致,而在肝组织中chHMGB1基因在28天达到表达的峰值,然后迅速下降维持在正常水平,病毒基因的表达一直处于一个波动的状态。 ALV-J感染鸡外周血单核细胞的Real-time PCR检测结果显示,不同毒株感染的鸡PBMC中chHMGB1与病毒基因的变化趋势完全一致,都是先升高后下降的过程。 3.高迁移率族蛋白B1抑制剂GR对ALV-J病毒复制的影响 为了探讨chHMGB1对病毒复制的影响,在本研究中使用了已报道的HMGB1功能抑制剂甘草酸苷(Glycyrrhizin, GR).感染ALV-J实验组分为加入GR组和不加入GR实验组,通过荧光定量PCR和间接免疫荧光检测病毒复制情况。结果显示,在加入GR后ALV-J病毒在DF1和CEF细胞中的复制明显增加。因此根据实验结果得知,加入GR抑制chHMGB1的功能,有利于ALV-J病毒在DF1和CEF在细胞中的复制；而在HD11细胞中实验结果恰恰相反。这些结果为进一步研究chHMGB1在ALV-J感染发病过程中可能发挥的作用提供依据。