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产抗菌脂肽GD菌株筛选及脂肽分离、鉴定与应用研究

庄国宏  
【摘要】:抗菌脂肽本质上属于抗菌肽的一种,是部分芽孢杆菌及非芽孢杆菌在生长繁殖过程中由细菌非核糖体产生的一类环状脂肽化合物,具有抗菌范围广、抗菌效果好、不易产生耐药性等诸多特点,是一类绿色、安全、高效的抗生素替代品,目前,越来越多的科研工作者将研究方向转移到此类抗菌物质的研发上。本研究在核查分离保存的微生物资源时,筛选并获得了一株对病原菌具有明显抑杀作用的枯草芽孢杆菌GD菌株,围绕该菌株及其抗菌活性物质进行了一系列研究,包括对枯草芽孢杆菌GD菌株常规生理生化及16S rDNA基因鉴定;对产生的抗菌物质进行了分离、纯化、鉴定;同时对其作用机理及理化因素影响、安全评价、动物试验和产业化发酵生产工艺等初步研究。研究结果表明:该菌株产生的代谢产物具有良好的抑菌效果,是一类绿色环保、安全高效的抗菌脂肽类化合物。 1、为了获得产抗菌物质的芽孢杆菌菌株作为后续研究对象,本实验采用鸡源大肠杆菌02作为指示菌,对研究所分离、保存的29株芽孢杆菌的代谢产物进行了抑菌效果检测,获得了4株抑菌圈在15mm以上芽孢杆菌;在此基础上,对其抗菌活性进行了抑菌谱的测定及理化因素稳定性试验,发现一株芽孢杆菌产生的抗菌物质对鸡源大肠杆菌抑菌圈达到20mm以上,对其他革兰氏阳性、阴性细菌及真菌均具有良好的抑菌和杀菌效果,理化性质稳定;同时,对该菌株进行了系统生理生化鉴定、16S rDNA测序鉴定,结果显示该菌株是一株产抗菌物质的枯草芽孢杆菌,将其命名为枯草芽孢杆菌GD株。 2、为了将来产品的开发与生产,本研究对枯草芽孢杆菌GD株产生的抗菌物质的主要成分、种类和特性进行初步研究。实验采用GD菌株的发酵培养液液,经大孔吸附树脂XD吸附、洗脱,将获取的粗提物与抗菌脂肽类化合物标准品进行薄层色谱(TLC)层析、分析、比较,结果表明,GD菌株代谢产物中的抗菌物质初步认为环状脂肽类化合物Surfactin(表面活性剂);在运用液质联用(LC-MS)分析技术对GD菌株产生的脂肽化合物Surfactin分离的基础上,对其在代谢产物中的含量、分子量及结构进行了分析,结果显示,枯草芽孢杆菌GD菌株在发酵合成的抗菌脂肽类化合物Surfactin(表面活性剂)含量达77.39%,分子量主要分布在1036.6933-994.6449之间,通过研究进一步确定了GD菌株产生的代谢产物是Surfactin A、Surfactin B和Surfactin C的同系混合物。 3、为了解抗菌脂肽类化合物Surfactin对细菌、真菌及酵母的抑菌作用机理与特点,采用GD菌株产生的脂肽类化合物Surfactin对鸡源大肠杆菌O2的生长曲线、菌体细胞膜通透性、超微结构及菌体细胞代谢活力等多方面进行了研究,结果表明抗菌脂肽化合物对鸡源大肠杆菌具有较高的敏感性,最小抑菌浓度为0.5mg/ml;其作用机理是通过破坏鸡源大肠杆菌细胞膜结构的完整性,造成菌体细胞内大分子物质泄漏及菌体细胞新陈代谢下降或丧失发挥其抑菌和杀菌作用。 4、为了将GD菌株及其代谢产物应用于生产,在对GD菌株产生的抗菌脂肽类化合物进行了急性毒性试验和亚急性毒性试验研究的基础上,对肉鸡饲料报酬和成活率等生产性能指标及对鸡源大肠杆菌O2感染的防治效果进行了初步研究。结果显示,当ICR小鼠在一次性灌胃量达5g/kg.BW时与对照组相比无任何临床症状和病理变化;采用250mg/kg.WB剂量经过30天亚急性毒性试验表明,除引起ICR小鼠血小板数上升(p0.05),其它指标均一切正常,表明GD菌株产生的抗菌脂肽类化合物对动物机体安全、无明显毒副作用。同时,在肉鸡饲料中按5mg/kg添加时其料肉比较抗生素组降低了0.12,差异极显著(p0.01),死亡率降低了4.33%,差异显著(p0.05);在对鸡源大肠杆菌防治观察中发现,预防组效果好于治疗组、同时使用抗菌脂肽与GD菌株的效果好于单用抗菌脂肽,说明GD菌株及其代谢产物作为饲料添加剂对肉鸡生长性能具有良好的调节与促进作用,对鸡源大肠杆菌O2感染具有一定的防治效果。 5、为了进一步提高GD菌株及其代谢产物的产量,降低生产成本,本研究采用P-B、B-B及田口法设计相结合,借助Minitab软件进行响应面分析,对影响枯草芽孢杆菌GD菌株产抗菌肽的发酵培养基中各种营养成分和发酵参数进行了优化,结果表明,影响脂肽化合物产生有3个重要因素,分别是植物蛋白、酵母粉和淀粉,经响应面分析获得了枯草芽孢杆菌GD菌株产脂肽类化合物的拟合数学模型。确定了枯草芽孢杆菌GD菌株的工业化生产培养基主要成分配比:植物蛋白25g/L、酵母粉5.02g/L、淀粉4.48g/L;采用此培养基发酵,抗菌脂肽类化合物产量为初始时的6.82倍,显著降低了生产成本,为工业化生产奠定了基础。


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