收藏本站
《扬州大学》 2014年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

利用特定转录因子的mRNA诱导获得山羊iPS细胞的研究

邱峰龙  
【摘要】:体细胞中导入特定的多能性转录因子可以将体细胞重编程为诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPS)。截止到目前,已成功的获得人、牛、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、猴、兔、猪等物种的iPS细胞。iPS细胞具有和胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESC)类似的多能性等特性,该技术对于难以建立胚胎干细胞系的动物无疑提供了一种可行的替代方案。但是,最初建立iPS细胞的传统方法是利用病毒载体将特定诱导因子Oct4、Sox2、Klf4和c-myc转入体细胞内,病毒的转染效率不能达到100%,获得4个诱导因子同时表达的细胞比例很低,且病毒载体会随机插入到体细胞的基因组中,可能导致正常基因的表达受到影响,或引起基因突变并激活原癌基因的表达。质粒载体、多蛋白表达系统、化学小分子以及转座系统虽然尽可能地减少了外源基因和病毒元件的整合,使获得iPS细胞的安全性获得提高,但由于操作复杂、分析困难、制备效率低等原因制约着iPS细胞制备技术的发展。相比于以上制备iPS细胞技术,mRNA诱导技术在理论上存在优势:一方面避开了外源基因插入体细胞基因组的风险;另一方面诱导效率较上述方法提高100倍,且细胞重新编程的速度提高了一倍。本研究利用mRNA诱导技术通过将山羊源性Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的mRNA导入山羊体细胞,对诱导体系和培养体系进行优化,成功将山羊体细胞重编程为山羊iPS细胞。此外,利用优化的培养体系将诱导获得的一株山羊iPS细胞成功传至22代。本文主要研究结果如下: 1.山羊iPS细胞相关的四个多能性转录因子的克隆与分析。 参考GenBank中已公布的山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc (简称OSKC)的序列,设计并合成相关特异性引物。采用RT-PCR的方法,从山羊胎儿生殖嵴、表皮和小肠组织获取山羊OSKC的编码序列(CDS)。测序结果表明,OSKC基因的CDS长度分别为1083bp、962bp、1434bp和1320bp。同源性分析表明,山羊OSKC核苷酸序列与山羊、绵羊、牛和猪相应序列具有高度的保守性,同源性分别为:Oct4(100%、100%、97%和94%),Sox2(100%、100%、98%和94%),Klf4(100%、100%、97%和94%),c-Myc (100%、100%、94%和91%,表明克隆获得的山羊各基因的序列正确。 2.不同pcDNA3.0真核表达载体的构建以及体外转录 将上述获得的OSKC基因和pcDNA3.0载体分别用相应限制性内切酶进行双酶切,连接转化后,经菌液PCR、单双酶切鉴定、测序,成功获得重组pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2. pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc真核表达载体。 按照体外转录试验的要求,成功获得“加尾”和“加帽”的各特异性转录因子的mRNA。 OSKC转录因子和EGFP的mRNA的浓度值分别为283.55g/ul、274.81ng/ul、448.54ng/ul、295.73ng/ul、315.43ng/ul, OD值分别为1.89、1.89、1.96、1.92、1.99;在260nm波长处10mm吸光度值有唯一极值。表明获得的OSKC基因和EGFP的mRNA较纯净,能满足后续转染试验的要求。 3.山羊iPS细胞诱导和培养体系的优化 本试验研究不同饲养层种类和培养液对山羊iPS细胞获得和培养的影响。结果显示,山羊iPS细胞在接种密度为“MEF细胞:GEF细胞=1:1”的饲养层上,用"KnockoutDMEM+20%KSR”组合的培养液,山羊iPS细胞的诱导效率以及消化传代后F2、F3代的克隆形成率最高,分别为1.15%、63.21%、36.98%。用形态学标准选择形态好的原代克隆进行扩大培养,一株山羊iPS细胞利用该培养体系已传至22代。 4.山羊iPS细胞的生物学特性 本试验诱导获得的山羊iPS细胞克隆呈集落性生长,克隆隆起呈岛状,细胞亮度高,边缘整齐、光滑、折光性强,细胞排列紧密,与饲养层细胞边界清晰,与山羊ES细胞克隆、小鼠iPS细胞克隆类似且AP染色呈阳性;RT-PCR试验结果表明山羊iPS细胞系表达多种ES细胞标记基因,包括Oct4、Sox2、Nanog、Daxl、Dnmt3b和Gdf3;免疫荧光检测结果表明山羊iPS细胞系表达ES细胞的标记物Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Rexl、SSEA-1TRA-1-60和TRA-1-81;山羊iPS细胞具有正常的核型,为58条常染色体和2条性染色体;山羊iPS细胞体外延时培养可自发分化成类上皮细胞、类神经细胞和类脂肪细胞,体外悬浮培养可形成类胚体。 5.mRNA诱导下的山羊体细胞重编程机制 细胞形态学试验结果表明转染nRNA后的山羊体细胞在形态上发生变化;qRT-PCR结果显示GEF细胞在转染]mRNA第12天后,内源性Nanog、Tert基因开始表达,结果表明内源调控网络机制被激活,并开始内源性基因的表达;Western blot试验结果与qRT-PCR结果类似,均表明内源调控网络机制在mRNA转染12天后被激活。综上所述,转染后初期体细胞的重编程主要依靠OSKC转录因子的外源表达来推动,12天后山羊iPS细胞多能性主要依靠相关转录因子的内源表达来维持。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S827;Q78

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 童英,刘爱民,尚克刚,刘林;兔ES样细胞系的建立及其特性分析[J];北京大学学报(自然科学版);1997年04期
2 张静南;刘永斌;张金吨;苏杰;李云霞;孙伟;赵丽霞;郭继彤;李喜和;;阿拉伯马染色体G带核型分析[J];华北农学报;2011年02期
3 张金吨;赵丽霞;吴宝江;李云霞;张静南;苏杰;孙伟;戴雁峰;郭继彤;胡树香;李瑶;汪玮;刘鹏涛;李喜和;;利用piggyBac载体制备小鼠诱导性多能干细胞[J];中国科学:生命科学;2012年07期
4 李松,窦忠英,华进联,李相运,宋文刚,曲迅;影响牛胚胎干细胞分离克隆因素的研究[J];生物技术通报;2002年03期
5 李斌;彭秋平;卢伟英;徐雯;金应霞;黄元华;;小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年03期
6 靳木子;马玉珍;仓明;王瑞;任宇;刘东军;;以两种不同成纤维细胞为饲养层培养牛胚胎干细胞的比较[J];畜牧与兽医;2010年06期
7 崔雯;熊浩;王杏龙;;饲养层和生长因子对山羊类胚胎干细胞的影响[J];中国畜牧杂志;2011年01期
8 宋成义;周家庆;冯晓军;谢雨琇;李庆平;吴晗;高波;王霄燕;;猪CatSperB和CatSperG基因的克隆、表达及生物信息学[J];中国农业科学;2012年21期
9 任卫青;张志平;许晓婷;邓立新;李小佳;吕婧玉;翟明胜;王新庄;;昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化[J];畜牧兽医学报;2013年02期
10 李珍珍;崔怡;高祎;成德;刘亚军;王华岩;;猪L-Myc基因的分子克隆及在细胞重编程中的应用[J];中国农业科学;2012年17期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 任子利;赵彦玲;王建洲;李瑜鑫;强巴央宗;;西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离与培养[J];安徽农业科学;2011年24期
2 徐小明,华进联,葛秀国,窦忠英;牛胚胎生殖细胞的分离与培养[J];动物学报;2004年05期
3 秦洁,李碧春,陈国宏,蔡琳琳,韩威,周冠月,吴洪,孙思宇;鸡胚胎原始生殖细胞的培养和传代[J];动物学报;2005年04期
4 周振明,桑润滋;胚胎干细胞分离和克隆影响因素的研究进展[J];黄牛杂志;2001年04期
5 周振明,桑润滋,韩建永,孙国杰,李俊杰;从早期胚胎分离和培养兔胚胎干细胞[J];河北农业大学学报;2002年03期
6 李松;高佩安;江新泉;窦忠英;苗增民;;从原始生殖细胞中分离克隆胚胎干细胞的研究[J];中国畜牧兽医;2008年06期
7 道日娜;刘刚;王蓉蓉;李云霞;戴雁峰;李喜和;李煜;李瑶;;猞猁3类组织体外培养细胞的生物学特性分析[J];中国畜牧兽医;2013年06期
8 刘刚;道日娜;王蓉蓉;李云霞;戴雁峰;李喜和;李煜;李瑶;;毛脚鵟细胞体外培养体系建立及三种组织来源细胞特性分析[J];动物学研究;2013年03期
9 李紫聪;黄晓灵;刘德武;吴珍芳;;转基因动物生物反应器研究进展[J];广东畜牧兽医科技;2013年04期
10 常胜合;徐立;李敬阳;孙威;王甲水;许桂莺;孙佩光;吴琼;金志强;舒海燕;;提高香蕉胚性愈伤诱导成功率的可能途径[J];安徽农业科学;2013年19期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 安立龙;效梅;张土保;董喜芳;许英梅;;不同浓度犊牛血清对三黄鸡原始生殖细胞生长、增殖的影响[A];中国畜牧兽医学会家畜生态学分会第七届全国代表大会暨学术研讨会论文集[C];2008年
2 周灿权;李宇彬;;研究中的生殖医学技术[A];中华医学会生殖医学分会第二次全国生殖临床学术研讨会论文汇编[C];2012年
3 张可华;袁宝珠;;治疗性干细胞产品相关的风险因素[A];2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集[C];2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 董晓;猪胚胎干细胞(EG)建系影响因素的研究[D];中国农业大学;2003年
2 华进联;人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究[D];西北农林科技大学;2005年
3 秦洁;鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究[D];扬州大学;2006年
4 黄奔;水牛胚胎生殖样细胞分离培养及相关研究[D];广西大学;2007年
5 余树民;小鼠胚胎干细胞建系的研究[D];西北农林科技大学;2007年
6 王芳;多囊卵巢综合征源性人胚胎干细胞系的建立及分化为脂肪细胞的相关研究[D];郑州大学;2010年
7 王瑞;牛胚胎干细胞培养条件以及差异表达基因的研究[D];内蒙古大学;2012年
8 贾蓓;A型血友病人非整合诱导多能干细胞建系及其细胞疾病模型的建立[D];南方医科大学;2012年
9 申晶;骨髓源间充质干细胞输注促进STZ诱导的糖尿病大鼠胰腺内α细胞向β细胞的转变:糖尿病治疗的新模式[D];中国人民解放军军医进修学院;2013年
10 朱玉德;胶质瘤干细胞的生物学特性及其与胶质瘤血管发生的关系[D];苏州大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张曼玲;猪单倍体孤雌胚胎和体外受精胚胎干细胞培养的研究[D];内蒙古大学;2011年
2 张镛镛;混合饲养层培养的人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化[D];郑州大学;2011年
3 汪彩珠;碱性成纤维细胞生长因子促进水牛类胚胎生殖干细胞形成的初步研究[D];广西大学;2011年
4 周振明;兔胚胎干细胞的分离与克隆[D];河北农业大学;2001年
5 孙国杰;山羊类胚胎干细胞的分离、克隆[D];河北农业大学;2002年
6 安静;鸡胚胎干细胞的分离、培养及鉴定[D];山东农业大学;2002年
7 章淑芳;小鼠ES细胞的定向诱导分化与建系实验研究[D];浙江大学;2004年
8 王娟;从原始生殖细胞中分离克隆鸡胚胎生殖细胞[D];山东农业大学;2004年
9 葛秀国;牛和山羊胚胎生殖细胞的分离与培养[D];西北农林科技大学;2004年
10 杨娜娜;小鼠白血病抑制因子基因的克隆、表达及维持鸡胚胎干细胞未分化状态的研究[D];山东农业大学;2005年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 童英,刘爱民,尚克刚,刘林;兔ES样细胞系的建立及其特性分析[J];北京大学学报(自然科学版);1997年04期
2 孙国杰,桑润滋,韩建永,金东航,田树军,周振明,李俊杰;山羊类胚胎干细胞的分离、克隆研究[J];河北农业大学学报;2003年03期
3 蔡有余,李胜利,须昌隆;马(Equus caballus)外周血淋巴细胞染色体的三种带型(G带、C带和Ag-NOR_s带)[J];动物学研究;1984年04期
4 王墨清;普氏野马染色体核型及多态性的研究[J];甘肃农业大学学报;1995年03期
5 张焱如,乌尼尔夫,白克力亚,芒来;内蒙古乌审马染色体核型研究[J];华北农学报;2005年01期
6 张静南;刘永斌;张金吨;苏杰;李云霞;孙伟;赵丽霞;郭继彤;李喜和;;阿拉伯马染色体G带核型分析[J];华北农学报;2011年02期
7 陈伟平;赵淑娟;庞有志;杨又兵;白俊艳;;伏牛白山羊染色体核型分析[J];黑龙江畜牧兽医;2008年05期
8 熊晓芸;;秋水仙素浓度对人体外周血淋巴细胞染色体标本制备的影响[J];江苏预防医学;2009年02期
9 孔丽娟;杨媛媛;王根林;;CatSper与精子超活化[J];中华男科学杂志;2007年02期
10 晁玉庆;国向东;赖双英;特古斯;;蒙古马染色体核型初步分析[J];内蒙古农牧学院学报;1992年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 钱铮;;日研究人员仅用2个基因成功培育出iPS细胞[J];浙江大学学报(农业与生命科学版);2009年02期
2 ;日本京都大学iPS细胞制备技术获得美日欧等31国专利授权[J];企业技术开发;2011年19期
3 姚理坤;王保宁;孟延发;;iPS细胞:一种肿瘤细胞[J];现代生物医学进展;2010年14期
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 记者 葛进;日本用iPS细胞制出部分肾脏组织[N];科技日报;2013年
2 记者 陈丹;首次用iPS细胞培育出功能性人类肝脏[N];科技日报;2013年
3 记者 刘霞;美用人体iPS细胞培育出人造血管[N];科技日报;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 孟书燕;小分子化合物在诱导山羊iPS细胞中的作用[D];西北农林科技大学;2011年
2 俞腾飞;异源因子诱导山羊IPS细胞[D];华中农业大学;2011年
3 李慧鹏;小鼠iPS细胞系的建立及向生殖细胞的诱导分化[D];内蒙古农业大学;2014年
4 邱峰龙;利用特定转录因子的mRNA诱导获得山羊iPS细胞的研究[D];扬州大学;2014年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026