收藏本站
《扬州大学》 2014年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

HA蛋白糖基化修饰对H5N1亚型禽流感病毒复制、致病性和抗原性的影响

张晓剑  
【摘要】:H5N1亚型高致病性禽流感在中国、越南、印度尼西亚、印度、孟加拉国和埃及呈地方流行性,给养禽业带来了巨大的经济损失。人可感染H5N1亚型高致病性禽流感,虽然目前还没有发现H5N1亚型AIV具有人传人的能力,但它们有可能通过抗原变异或病毒重配方式获得人传人的能力,对人类存在巨大的潜在威胁性。因此高致病H5亚型AIV是非常重要的人兽共患病。血凝素蛋白(HA)是流感病毒表面主要的保护性抗原,它在合成时通常都经过糖基化修饰的过程。随着H5N1禽流感病毒迅速进化,新的变异clade病毒不断出现,HA蛋白表面糖基化位点模式日益复杂化。本研究以AIV A/Mallard/Huadong/S/2005 (H5N1, Clade 2.3.4)为模型,利用点突变方法在HA蛋白表面添加或删除糖基化位点,从而构建了HA蛋白上含不同糖基化位点模式的突变病毒,以研究HA蛋白糖基化位点对AIV生物学特性、致病性和抗原性的影响。1.H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白头部糖基化位点突变株的构建及生物学特性研究以SY株为母本病毒,利用反向遗传技术在HA蛋白头部添加或删除糖基化位点(144、158和169位),从而构建了HA蛋白上含不同糖基化位点模式的突变病毒,并测定了各重组AIV的生物学特性。结果显示,去除158位糖基化位点不但可以显著增强HA蛋白与唾液酸受体的亲和力,还可以让H5N1亚型AIV具备a2,6唾液酸受体的结合能力,而在HA蛋白头部保留144位和169位糖基化位点同时去除158位糖基化位点时,AIV结合a2,6唾液酸受体的能力最强。在MDCK细胞上,单独缺失HA蛋白158位或169位糖基化位点对AIV体外复制起抑制作用,表现为空斑直径减小。在158位糖基化位点存在的前提下,添加144位糖基化位点可增强AIV体外复制能力,表现为空斑直径增大。各重组病毒在CEF细胞上的复制能力无明显差异。综上所述,HA蛋白头部糖基化位点可影响AIV受体结合和体外复制能力。2.HA蛋白头部糖基化修饰对H5N1亚型禽流感病毒哺乳动物致病性的影响将各重组病毒以鼻内接种途径感染6周龄BALB/c小鼠,感染剂量分别为104EID50和106EIDso。在104 EID50攻毒剂量下,突变病毒rSˇ144+/158-/169-和rS-144+/158-/169+以及野生型病毒感染组小鼠平均体重下降轻微(-10%),其他病毒感染组小鼠平均体重下降剧烈(20%)。此外,在突变病毒rS-144-/158-/169+和rSˇ144-/158+/169-感染组内,所有动物在感染后9天内死亡。另一方面,当攻毒剂量为106EIDso时,所有感染动物全部死亡。用104 EID50的剂量感染各重组病毒,分别在感染后3天和6天采集各小鼠脏器,滴定其中病毒滴度,以评价各重组病毒组织扩散能力。结果发现,在感染3天和6天时,所有感染动物肺脏中都能检测到病毒。单缺失158位或169位糖基化位点的流感病毒呈全身性感染,各组织脏器中病毒滴度均达到较高水平。而野生型病毒的感染只局限在小鼠肺脏中。另外,这两株单缺失病毒感染小鼠后,可在其肺脏中诱导高水平的细胞因子,与野生型病毒感染组存在显著性差异。因此,单独缺失HA蛋白158位或169位糖基化位点,可增强病毒的毒力及组织扩散能力,并且诱导高水平的炎性因子。3.HA蛋白头部糖基化修饰对H5N1亚型禽流感病毒抗原性的影响为了评价糖基化修饰对流感病毒抗原性的影响,我们制备了各重组病毒高免血清,并测定了各组血清与不同clade流感病毒的交叉反应性。结果发现,相比于野生型病毒抗血清,rS-144-/158+/169-组抗血清具有良好的交叉中和能力。因此,我们选择其作为疫苗候选株进一步评价了其攻毒保护情况。结果发现,当以致死量的SY, DT和ZJ株流感病毒攻毒时,两疫苗组均可提供完全保护(100%);而当以致死量的WX株流感病毒攻毒时,两免疫组均提供70%的保护。另外,rS-144-/158+/169-免疫鸡在攻毒后,排毒率低于野生型病毒疫苗免疫组,且在DT株流感病毒攻毒后7天时尤其明显。因此,rS-144-/158+/169-免疫后可产较好的交叉中和抗体,抑制病毒排毒的能力优于野生型病毒。4.HA蛋白头部糖基化修饰对H5N1亚型禽流感病毒诱导细胞因子的影响选择A549细胞为体外感染模型,进一步分析了野生型病毒及两株单缺失病毒诱导细胞因子的能力差异。结果表明,与野生型病毒相比,缺失株rS△169在A549细胞上的增殖能力无明显差异,而缺失株rSA158在A549细胞上的增殖能力略有提高,但差异不显著。两突变病毒感染后6h均可检测到IFN-β表达水平上调,且显著高于野生型病毒,与其相关的还有干扰素诱导蛋白(CXCL10)的上调。CCL2的差异性表达较晚,发生在感染后24 h,而IL-8的差异性表达较早,出现在感染后6 h。另外,IL6和TNF-α均能显示差异性表达。进一步研究发现,病毒感染A549后,NF-κB炎症通路被激活,但不同病毒激活通路的程度有差异,突变病毒rSA 158激活通路的能力最强,而突变病毒rS△169激活通路的能力与野生型病毒相当。3株流感病毒感染均可干扰IFN-α诱导的STAT1的磷酸化作用,而对IFN-y诱导的STAT1的磷酸化作用无显著影响。因此,HA蛋白158位糖基化位点缺失病毒诱导细胞因子上调与NF-κB通路激活有关。5.H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白茎部糖基化位点突变株的构建及生物学特性研究采用点突变和反向遗传的方法构建了HA蛋白茎部含不同糖基化位点(11位、23位和286位)的H5N1亚型AIVs,并测定了各重组病毒的生物学特性。研究结果表明,所有组合的HA蛋白糖基化位点缺失重组AIV均可成功拯救,由此可见HA蛋白茎部糖基化位点的缺失不影响感染性子代病毒的产生。缺失11位糖基化位点可降低HA蛋白的裂解效率,如同时缺失23位或286位糖基化位点时,HA蛋白的裂解则被完全阻断,这两株茎部糖基化双缺失病毒在MDCK和CEF细胞上的复制能力显著降低。此外,茎部糖基化位点的缺失可使流感病毒热稳定性和pH稳定性下降,尤其是11位糖基化位点的缺失。因此,茎部11位糖基化位点对HA蛋白裂解和结构稳定起关键作用。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S852.65

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 周鸿飞;禽流感病毒真面目[J];光明中医;2004年01期
2 ;禽流感病毒分布有明显的地域性相关[J];山东家禽;2004年03期
3 洪水根;各国通力合作 围剿禽流感[J];厦门科技;2004年01期
4 徐瑛;珍爱生命、关注社会、抗击禽流感——7年级生物学课堂实录[J];生物学通报;2004年04期
5 ;低温下的禽流感病毒能存活更长时间[J];饲料与畜牧;2004年06期
6 魏秀俭,李晓鹏;禽流感病毒概述[J];聊城大学学报(自然科学版);2004年03期
7 ;科学与禽流感之间的战争[J];科技资讯;2004年05期
8 ;我国禽流感病毒研究新发现[J];中国牧业通讯;2005年19期
9 范宗理;鸭子可扩大禽流感病毒传播的危险性[J];自然杂志;2005年03期
10 然悠;直面禽流感[J];苏南科技开发;2005年11期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 孙晓林;;禽流感和公共卫生[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集[C];2003年
2 何义林;叶冬青;;禽流感病毒对人类感染机制的研究进展[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年
3 春阳;李东;;再论“以科学发展观应对禽流感事件”——评禽流感病毒变种两次恐慌论[A];首届中国黄羽肉鸡行业发展大会会刊[C];2008年
4 邓洁丽;段明星;俞初一;江龙;;聚联乙炔有序组装体在识别禽流感病毒方面的应用研究[A];中国化学会第十二届胶体与界面化学会议论文摘要集[C];2009年
5 孙恩泽;谢敏;赵海粟;黄碧海;刘书琳;张万坡;张志凌;王汉中;庞代文;;量子点标记禽流感病毒[A];第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2009年
6 黄志坚;陈强;李清禄;王寿昆;江和基;;不同消毒剂对禽流感病毒的杀灭试验[A];福建省科协第八届学术年会分会场“转变饲养方式,促进海西畜牧业和谐发展”学术年会论文集[C];2008年
7 周祖华;张敏;程礼明;徐彬;沈彩信;;禽流感流行趋势分析[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
8 王志宇;张议文;刘桂林;;禽流感病毒的分子生物学研究进展[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
9 刘迎芳;饶子和;;禽流感病毒(H5N1)RNA聚合酶PA亚基相关三维晶体结构与功能分析[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年
10 韦婷;胡杰;兰彬;陆文俊;苏凯;覃芳芸;;广西暴发中低毒力禽流感情况报告[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 农业部动物疫病诊断与流行病学中心主任 崔尚金 博士;候鸟发生禽流感给我们的警示[N];中国畜牧兽医报;2005年
2 莫书莹;世卫警告:禽流感或大流行全球经济应警惕[N];第一财经日报;2005年
3 本报记者 魏红欣;禽流感“啄”痛全球经济[N];国际金融报;2005年
4 本报记者 许凯;狙击禽流感:一场鸟与人的战争[N];国际金融报;2005年
5 新华社记者 杨爱国;防控禽流感需要加强国际合作[N];光明日报;2005年
6 李杨;禽流感疫情不会长期影响农产品期价[N];金融时报;2005年
7 罗政、夏文辉;香港强化防止禽流感措施[N];人民日报海外版;2004年
8 本报记者 张向永 赵秀芹;禽流感让全世界手牵手[N];市场报;2005年
9 ;禽流感病毒能否绝迹?[N];中国石油报;2004年
10 何源;严防禽流感从境外传入我国[N];中国食品质量报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 邹镇;H5N1型禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒致急性呼吸损伤的机理研究[D];北京协和医学院;2012年
2 赵蔚;基于磁分离和荧光量子点标记的高灵敏禽流感病毒检测[D];武汉大学;2012年
3 区嘉贤;H7N9禽流感患者的临床特征及预后分析[D];复旦大学;2014年
4 刘三红;禽流感的数学建模及数值模拟[D];华中师范大学;2015年
5 樊兆斌;野鸟源禽流感病毒(AIV)分离株的遗传进化及其致病性研究[D];东北林业大学;2014年
6 桑晓宇;H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠模型中水平传播的分子机制研究[D];中国农业科学院;2015年
7 杨文涛;靶向树突状细胞通用型禽流感病毒重组乳酸菌的研究[D];吉林农业大学;2015年
8 石霖;北方某省主要亚型禽流感现地调查分析及RT-LAMP检测方法研究[D];东北农业大学;2015年
9 张晓剑;HA蛋白糖基化修饰对H5N1亚型禽流感病毒复制、致病性和抗原性的影响[D];扬州大学;2014年
10 崔尚金;我国禽流感的流行病学调查[D];中国农业科学院;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高晓龙;2014年度中国东部候鸟禽流感病毒分离与鉴定[D];中国农业科学院;2015年
2 徐晓龙;H5和H7亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立[D];中国农业科学院;2015年
3 韩苗苗;一类人畜共患的禽流感传染病传播模型[D];大连理工大学;2015年
4 王秋珍;H9N2禽流感病毒NS1蛋白诱导的氧化应激促进DF-1细胞凋亡[D];西北农林科技大学;2015年
5 梁威;5株H9N2亚型AIV血凝素结构分析及感染A549细胞的蛋白质组学研究[D];山东农业大学;2015年
6 刘媛媛;MDCK细胞表达鸡ST3GAL I基因对H9亚型禽流感病毒增殖情况的影响[D];河南农业大学;2013年
7 孟芳;H9N2亚型禽流感HA基因演化及其内部基因在H5N2亚型流感病毒演化中的作用[D];山东农业大学;2015年
8 韩雯;山东地区H9N2禽流感流行病学调查及流行毒株分子生物学检测[D];山东农业大学;2014年
9 查国飞;昆虫细胞表达重组H5亚型禽流感HA蛋白及其免疫原性研究[D];安徽农业大学;2014年
10 侯群;新疆青格达湖湿地鸟类中H5、H7亚型AIV和NDV流行病学监测[D];石河子大学;2015年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026