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《扬州大学》 2014年
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重组人雌激素受体基因酵母细胞对家畜尿液中雌激素类药物残留的检测研究

达剑森  
【摘要】:动物性食品中雌激素类药物残留对人类健康造成损害,同时还影响到环境和畜牧业可持续健康发展,并引起了广泛的关注。目前,检测雌激素类药物残留的检测方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC),酶联免疫分析法(ELISA)等。这些方法有其优点,也有其局限性,都存在对检测操作人员、精密检测仪器要求高,对待测样品有一定的纯度要求,受检测场地等因素限制等缺点,不适用于常规动物食品安全监督。因此,建立简便、快速、有效的动物体内雌激素类药物残留检测方法显得尤其重要。本文构建了重组人雌激素受体(hER)基因酵母细胞(W303-1A/hER-ERE-Lac Z, W303-1A/hER-ERE-yEGFP), W303-1A/hER-ERE-Lac Z是一种酵母细胞传感器,其Lac Z报告基因受hER的调控,当雌激素类药物与hER结合时,会使LacZ基因的表达产物β-半乳糖苷酶大量升高,通过测其活性,可以监测尿液中雌激素类药物的含量,特别适合基层单位开展日常的监测工作;而W303-1A/hER-ERE-yEGFP是一种发光酵母细胞,通过测其发光度,检测尿液中雌激素类药物的含量,不需添加任何试剂,具有快速简便的特点。构建方法和应用如下:材料与方法:(1)将受雌激素效应元件调控的pMP206/ERE和pLZ-yEGFP载体用醋酸锂(LiAC)方法,分别转化于可表达雌激素受体(hER)的酵母细胞,经SD/-trp,-ura选择性培养板,筛选出阳性转化子,并对其进行PCR鉴定,从而构建成受雌激素调控的Lac Z基因酵母细胞和yEGFP发光酵母细胞,分别命名为W303-1A/hER-ERE-Lac Z和W303-1A/hER-ERE-yEGFP,并将其划线接种于SD/-trp,-ura选择平板上,于30℃培养出克隆;(2)从重组基因酵母培养板挑取单个酵母克隆,于酵母培养液30℃振荡培养活化,并用酵母细胞培养液稀释3倍;(3)从规模化养殖场采集犊牛、怀孕母牛尿样计22份,采集不同阶段仔猪和母猪尿样计78份,分别经过滤、水解、C18柱吸附、用三氯甲烷洗脱、经二甲基亚砜处理定容处理;(4)取0.010 mL甲基亚砜定容液分别作用于W303-1A/hER-ERE-Lac Z和W303-1A/hER-ERE-yEGFP细胞,30℃振荡作用6 h,分别测β-半乳糖苷酶的活性或细胞的发光强度。用雌二醇(己烯雌酚、炔雌醇)作为阳性对照,蒸溜水作为试剂空白对照。结果:两种重组基因酵母细胞对所有的加标(雌二醇、己烯雌酚、炔雌醇)均呈阳性结果。用W303-1A/hER-ERE-Lac Z测定,雌二醇的检出限为10-12mol/L,怀孕母牛、犊牛、仔猪和不同时期母猪的尿样中的雌激素类化合物与空白对照比较无显著性差异(P0.05);仔猪与不同时期母猪尿样中雌激素化合物未发现统计学差异(PO.05);用W303-1A/hER-ERE-yEGFP研究发现,虽然怀孕母牛尿样中的雌激素化合物高于犊牛,但经统计分析无显著性差异(PO.05),而仔猪与不同时期母猪尿样中的雌激素化合物浓度很低,低于W303-1A-hER-ERE-yEGFP细胞的检出限水平(10-9mol/L雌二醇当量)。结论:(1)该方法可检测已知和未知的具有雌激素样作用的化合物或药物,具有简便、快速、灵敏等特点,适合大量样本的基层初级筛选;(2)该方法样品对象为尿液,相对于其他样品,采集比较方便,并能实现活体检测,可在降低畜产品质量安全监测成本的同时,对畜产品质量安全监管实行及时有效预警;(3)本文所采集的样品均来自规模化养殖企业,饲养比较规范,未在饲料中非法添加雌激素类药物。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S859.84

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