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《扬州大学》 2014年
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鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程关键基因的研究

张振韬  
【摘要】:在有性繁殖生物中,生物体的遗传信息通过精卵结合实现了世代间的传递。在这个过程中,生殖干细胞扮演着重要的角色,受到了动物胚胎学、发育生物学和细胞生物学等学科的关注。同时,生殖干细胞因其优良的可塑性使其成为了干细胞治疗和遗传修饰重要选择。目前,人们对胚胎干细胞向生殖细胞分化过程中分子机制的研究还不全面,仅局限于对个别基因或信号通道的调节作用的探索,对分化各阶段基因表达变化还没有一个整体的认识,通过他们的研究无法了解基因变化的全貌,无法寻找到一个在这分化过程中起关键作用的基因或者信号通路。因此,本研究选择了在ESCs向雄性生殖细胞分化程中三种关键的细胞:胚胎干细胞(ESCs),原始生殖细胞(Primordial gemr cells,PGCs)和精原干细胞(Spermatogonial Stem cell,SSCs),通过Microarray和RNA-seq两种高通量的方法检测了三种细胞在分化各阶段的基因表达变化情况,从而全面的掌握基因的变化趋势,以及调节情况,寻找其中的关键基因。本研究中对ESCs及不同时期雄性生殖细胞中生殖相关基因的表达情况的研究将有助于深入了解和认识生殖细胞的产生过程,为今后的试验提供理论依据和参考。同时,对ESCs向雄性生殖细胞分化中关键基因的探寻为基因调控信号网络的研究奠定了基础,为在体外诱导获得大量生殖细胞提供理论基础。研究结果如下:1、对禽类三种干细胞进行了 Microarray实验结果显示,ESCs与PGCs共有20087个差异基因,其中9393个上调,10694个下调;ESCs与SSCs共有20020个差异基因,其中9209上调,10811个下调;PGCs与SSCs共有17090个差异基因,其中8611上调,8479个下调。Microarray检测结果中三种细胞间存在差异,差异基因数量随着差异倍数的增加而减少。约57%的差异基因倍数小于两倍,仅有约0.1%的差异基因倍数大于10倍。GO分析结果显示差异基因在生物过程中,主要注释到了转录调节中;在细胞组成中的差异基因最多的为细胞核;在分子功能分类中主要为结合,包括核酸结合、金属离子结合等。2、采用Illumina Solexa转录组测序技术对禽类三种干细胞进行转录组测序结果发现,在ESCs与PGCs组共产生差异基因7697个,其中4187个基因在PGCs中上调表达,3510个基因在PGCs中下调表达。在ESCs与SSCs组共产生差异基因7968个,其中4944个基因在PGCs中上调表达,2924个基因在PGCs中下调表达。在PGCs与SSCs组共产生差异基因6226个,其中3876个基因在PGCs中上调表达,2350个基因在PGCs中下调表达。GO分析结果显示,在ESCs和PGCs比较后,共有差异基因为7697,其中有5825个差异基因注释到40个GO条目中。在40个条目中,21条与生物学过程相关,8条与细胞成分相关,剩余的11条与分子功能相关。在ESCs和SSCs比较后,共有差异基因为7968,其中有5968个差异基因注释到40个GO条目中。在40个条目中,21条与生物学过程相关,8条与细胞成分相关,剩余的11条与分子功能相关。在PGCs和SSCs比较后,共有差异基因为6226,其中有4482个差异基因注释到37个GO条目中。在37个条目中,21条与生物学过程相关,7条与细胞成分相关,剩余的9条与分子功能相关。3、初步筛选出GAL9、AMH、PLK1 PSMD7等173个候选关键基因,其中持续上调基因25个,持续下调基因14个,ESCs特异表达基因18个,PGCs特异表达基因58个、SSCs特异表达基因16个,其它基因46个;按功能分类后发现,98个基因参与细胞分化,19个基因参与了代谢过程,56个基因共同参与了分化和代谢过程。在本实验数据结果中共发现115个未知新基因(细胞间差异倍数7倍以上)其中ESCs特异表达未知基因52个,PGCs特异表达19个,SSCs特异表达46个。4、选择 XM_001233327、XM_424100、NM_001030786、XM_416629 四个在 PGCs中特异表达的未知新基因进行深入分析。对候选特异基因生物信息学分析显示,所选4基因主要与鸟类同源性较高,但同源蛋白也均为未知蛋白,基因未被命名;候选特异基因结构域分析显示,除XM_424100中预测发现了跨膜转运蛋白52超家族(transmembrane protein 52,TMEM52)的结构域外,其余三个基因未发现特异的结构域,基因功能需要进一步研究。综上,本研究通过对鸡ESCs、PGCs及SSCs三种细胞表达谱及转录组数据分析后,共筛选到调控ESCs细胞向雄性生殖细胞方向分化候选关键基因173个,未知新基因115个,并初步对四个新基因功能进行了研究。本实验结果将为揭示生殖细胞发育的奥秘提供重要的参考依据,为体外诱导获得生殖细胞提供有力的理论支持。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S831

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