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《扬州大学》 2017年
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虫草素对鱼藤酮诱导的PD模型多巴胺能神经元的保护作用及其抗凋亡机制研究

姜新  
【摘要】:目的:探讨虫草素(Cor)对鱼藤酮(Rot)诱导的PD模型多巴胺(DA)能神经元的保护作用及其抗凋亡机制。方法:1.体内实验:大鼠皮下注射(s.c.)Rot 1.0 mg/kg/d,早晚各一次,共给药30天制备PD大鼠模型。实验分为对照组(i.g.生理盐水)、模型组和Cor低剂量组(2.5 mg/kg)、Cor中剂量组(5.0 mg/kg)和Cor高剂量组(10.0mg/kg)。Cor提前3天i.g.给药,每天一次,共33天。以评分法和网格实验考察大鼠行为学变化,HE染色观察黑质DA能神经元形态,TH免疫组织化学检测黑质致密部TH免疫阳性细胞数目,HPLC-ECD法测定纹状体DA、5-HT及其代谢产物的含量。2.体外实验:1.0 μmol/L Rot作用PC 12细胞48h制备PD细胞模型。实验分为对照组(0.01%DMSO)、模型组和Cor给药组(0.4×10-6、2.0×10-6、8.0×10-6μmol/L)。Cor预先加入一定时间后再加入Rot,共同作用48h。MTT法测定细胞存活率,AnnexinV/PI流式细胞仪测定细胞凋亡比率,DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量,罗丹明123染色检测细胞线粒体膜电位,RT-qPCR 和 Western blotting 测定细胞内 Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Cleavedcaspase-9、Fas 和胞浆中 Cyt-c 的表达。结果:1..Cor对Rot诱导的PD大鼠黑质DA能神经元的保护作用给药30天后,模型组大鼠出现震颤,单侧旋转,少数出现单侧瘫痪等现象,与对照组相比,行为学评分显著增多(P0.01),网格实验中移动潜伏期明显延长(P0.01)。黑质神经元细胞稀疏、胞体小、核变大、轮廓模糊,胞内有气泡形成,有的出现嗜酸性细胞,TH免疫阳性神经元的数目较对照组明显下降(P0.01),纹状体中DA、DOPAC、HVA、和5-HT、5-HIAA的含量也均显著降低(P0.01)。Cor预处理后,大鼠上述运动障碍得到明显改善,行为学评分显著下降(P0.01),移动潜伏期明显缩短(P0.01),黑质中存活神经元细胞数目明显增加,嗜酸性细胞消失,神经元细胞的形态得到改善,TH免疫阳性神经元数目较模型组明显增多(P0.05,P0.01),纹状体中上述神经递质及其代谢产物的含量均显著增高(P0.01),作用随剂量的增加而增强。结果提示Cor具有保护PD大鼠DA能神经元的作用。2.Cor抑制Rot诱导的PC12细胞凋亡作用的机制研究(1)对细胞损伤及凋亡的影响:与对照组相比,Rot使PC12细胞存活率明显下降(P0.01),细胞早、晚期凋亡以及总凋亡率显著上升(P0.01),同时细胞内Caspase-3 mRNA和蛋白的表达量明显升高(P0.01)。不同浓度Cor分别预处理12h,24h和36h后,细胞存活率较模型组相比均有显著提高(0.4×106μmol/LCor预处理12h组除外),预处理24h作用最好。Cor干预后,细胞早期及晚期凋亡细胞明显减少,总凋亡率显著下降(P0.01)。与模型组比较,Caspase-3 mRNA和蛋白表达量未有明显变化(P0.05),但Cleaved caspase-3的表达量显著降低(P0.01),Cor上述作用随剂量增加而增强。提示Cor能够抑制Rot诱导的细胞凋亡。(2)对细胞内ROS含量的影响:与对照组比较,模型组细胞ROS比值显著升高(P0.01),Cor预处理24 h后,ROS比值明显下降(P0.01),剂量越大作用越强。表明Cor能够降低细胞内ROS的含量,抑制Rot诱导的氧化应激反应。(3)对介导细胞凋亡的线粒体途径研究:与对照组相比,模型组细胞中Bax、Caspase-9 mRNA和蛋白表达均显著增加(P0.01),而Bcl-2 mRNA及其蛋白表达明显降低(P0.01),Bcl-2/Bax比值显著下降(P0.01);同时检测到MMP下降(P0.01),胞浆中Cyt-c蛋白水平也显著增加(P0.01)。Cor预处理24 h后,细胞内Bax表达量明显下降(P0.01),Bcl-2表达量显著升高(P0.01),Bcl-2/Bax比值也随Cor浓度增加而上升。同时,Cor还使MMP显著升高(P0.05,P0.01),胞浆中Cyt-c蛋白水平明显降低(P0.01),Cor浓度越大作用越强。此外,Cor的干预对Caspase-9的表达没有明显影响(P0.05),但能显著降低细胞内Cleaved caspase-9的表达量(P0.01)。提示Cor可能是通过线粒体途径发挥抑制细胞凋亡的作用。(4)对介导细胞凋亡的死亡受体途径研究:模型组细胞内Caspase-8、Fas mRNA及其蛋白表达量与对照组比较均明显升高(P0.01)。Cor预处理后,细胞内Caspase-8、Fas表达量与模型组相比明显降低(P0.05,P0.01),8.0×10-6μmol/LCor作用最明显。提示Cor对Rot诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用与死亡受体途径有关。结论:Cor对Rot诱导的PD大鼠DA能神经元损伤具有保护作用,这一保护作用可能与减少氧化应激损伤,改善线粒体功能障碍,并通过线粒体途径和死亡受体途径共同发挥抑制细胞凋亡作用有关。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285.5

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