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《扬州大学》 2017年
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肠炎沙门菌转录因子SEN2967和SEN3610调控基因的筛选与鉴定

陈韵  
【摘要】:肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovar Entrritidis,S.Enteritidis,SE)是革兰阴性兼性胞内寄生菌,对人类和动物都具有致病性,是重要的人兽共患病原菌。转录因子(Transcriptionfactor,TF)是一类能够结合在特定基因上游特异核苷酸序列上的蛋白,并能调控该基因的转录。转录因子可调控细菌毒力因子的表达,参与生理生化代谢过程,因此对沙门菌转录因子的研究对于沙门菌致病机制与防控研究都具有重要意义。本实验室前期研究中利用SCOTS技术筛选肠炎沙门菌感染禽源巨噬细胞HD-11的过程中表达的基因,两个候选转录因子SEN2967和SEN3610基因的胞内转录水平显著高于体外培养状态下的表达水平,但国内外对这两个假定转录调控因子的研究未见报道。本研究通过同源重组的方法成功构建了肠炎沙门菌SEN2967和SEN3610基因缺失株及其诱导型表达株;并通过双向电泳、iTraQ技术对二者调控的基因表达进行了分析;对于筛选获得的基因,采用EMSA进行验证。1肠炎沙门菌C50041转录因子SEN2967和SEN3610的缺失株与表达株的构建及其生物学特性鉴定利用荧光定量PCR比较肠炎沙门菌C50041感染HD-11细胞5 h后与体外培养条件下转录水平的表达差异,证实SEN2967上调约98倍,SEN3610上调约15倍。本研究利用λ-red同源重组系统成功构建了肠炎沙门菌缺失株C50041△SEN2967、C50041△SEN3610*pBad24及以 pBad24 为载体的诱导型表达株 C50041△SEN2967(pBad24-SEN29673*Flag)、C50041△SEN3610(pBad24-SEN36103*Flag)。Western Blot 结果显示,诱导型表达株中SEN2967和SEN3610蛋白经诱导后均成功表达。生物学特性结果表明,SEN2967和SEN3610的缺失均不影响肠炎沙门菌的生理生化特性;小鼠体内竞争实验表明,SEN2967和SEN3610缺失株的致病力均明显低于野生株C50041。肠炎沙门菌SEN2967和SEN3610基因缺失株和诱导型表达株的成功构建为后期筛选SEN2967和SEN3610调控的基因表达研究提供了相应的生物材料。2肠炎沙门菌C50041转录因子SEN2967和SEN3610的蛋白质组学研究本研究通过双向电泳分析SEN2967和SEN3610缺失株与表达株的蛋白表达水平差异。分别提取SEN2967和SEN3610的缺失株和表达株的全菌蛋白,在确保上样量一致的前提下,进行双向凝胶电泳,银染后扫描获得2D图谱,经PD Quest软件分析,检测出SEN2967的缺失株和表达株有56个差异蛋白点,检测出SEN3610的缺失株和表达株有91个差异蛋白点。随后我们利用iTraQ技术检测缺失株与表达株中表达差异的蛋白谱,在差异倍数≥1.5或者≤0.67倍,P值≤0.05的条件下,SEN2967缺失株与诱导型表达株相比,上调表达的蛋白有81个,下调表达的蛋白有90个,共计差异数量171;SEN3610缺失株与表达株相比,上调表达的蛋白有25个,下调表达的蛋白有21个,共计差异数量46。这一结果与双向电泳均表明SEN2967和SEN3610基因的缺失或诱导表达可以引起细菌中其它蛋白表达的变化。iTraQ结果进一步显示,在SEN2967和SEN3610缺失株中下调表达的蛋白库中存在与T3SS紧密相关的蛋白,主要包括SPI-1和SPI-5的效应蛋白,以及与针状结构形成相关的蛋白。选择部分与T3SS相关且表达量差异明显的蛋白表达基因,利用荧光定量PCR检测转录水平的表达差异,结果表明转录水平与翻译水平的表达并非平行关系。本研究筛选获得的蛋白为进一步研究SEN2967和SEN3610在肠炎沙门菌转录调控过程中参与的信号通路奠定了基础。3肠炎沙门菌C50041转录因子SEN3610调控基因的EMSA验证为了筛选和鉴定转录因子SEN3610直接调控的基因,我们利用EMSA实验来检测转录因子和调控的基因启动子之间的相互作用。首先利用pMAL-5载体成功构建了 SEN3610原核表达载体,获得重组菌株、E.coli ER2523(pMAL-c5X-SEN3610)和E.coli ER2523(pMAL-p5X-SEN3610);纯化回收MBP-SEN3610融合蛋白约40 mg,并经透析后用于EMSA实验。根据第二章筛选获得的基因序列,分别定位其启动子序列,通过两级PCR合成5' FAM荧光标记的探针。在EMSA反应体系下验证SEN3610与各探针的结合情况。结果表明,SEN3610与hilA,hilD和pipD的启动子序列有明显的结合现象。这一结果表明SEN3610可能通过参与调控hilA和hilD的表达间接参与调控T3SS效应蛋白的表达。为深入研究T3SS的表达调控奠定了基础。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R378;S852.61

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