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《扬州大学》 2017年
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阿帕替尼对脉络膜视网膜新生血管的抑制作用及分子机制的实验研究

张铭  
【摘要】:第一部分:阿帕替尼对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管的抑制作用目的:观察阿帕替尼对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管形成的抑制作用。方法:60只6-8周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为4组,每组15只,即正常对照组及实验组(生理盐水组、低剂量阿帕替尼组和高剂量阿帕替尼组)。实验组构建激光诱导的小鼠CNV模型,均为右眼。建模后即采用灌胃的方式,实验组分别给予生理盐水、低、高剂量的阿帕替尼治疗7d;建模后第7d分别采用荧光素眼底血管造影(FFA)观察各组脉络膜新生血管区面积及渗漏变化;行脉络膜铺片进一步测量新生血管区面积的大小并作组织病理学检查。结果:(1)FFA结果显示:与正常对照组比较,生理盐水组可见大面积脉络膜新生血管区形成,证明造模成功。对每组各只小鼠激光点的渗漏等级进行评分,组间总体差异有统计学意义(F=51.76;P=0.000);其中,生理盐水组的渗漏评分为(8.43±0.50)分,低剂量阿帕替尼组的渗漏评分为(7.84±0.50)分,高剂量阿帕替尼组的渗漏评分为(6.13±0.90)分。与对照组比较,低剂量阿帕替尼组及高剂量阿帕替尼组渗漏评分显著降低(P=0.020;P=0.000),且高剂量阿帕替尼组较低剂量阿帕替尼组荧光渗漏评分低(P=0.000)。(2)脉络膜铺片结果显示:正常小鼠脉络膜铺片中视网膜色素上皮细胞被F-actin染色呈现规则的六边形结构;脉络膜铺片新生血管面积组间总体差异有统计学意义(F=143.72;P=0.001);生理盐水组被激光破坏掉的视网膜色素上皮层区域可见IB4标记的呈辐射状脉络膜新生血管区域,其脉络膜新生血管区的面积为(100.00±6.00)μm2;阿帕替尼干预组中可见IB4标记的脉络膜新生血管区面积明显减小,其中高剂量阿帕替尼组新生血管区面积为(28.00±4.00)μm2,低剂量阿帕替尼组新生血管区面积(66.88±8.41)μm2,两组新生血管区面积与生理盐水组比较差异具有统计学意义(P=0.001),高剂量组小于低剂量组新生血管区面积,差异具有统计学意义(P=0.000)。(3)对新生血管区域行HE染色,结果显示:组间总体差异有统计学意义(F=1899;P=0.000);与正常对照组比较,生理盐水组有明显的新生血管形成,且长度和厚度分别为(392.86±3.54)μm和(96.05±6.58)μm,差异有统计学意义(P=0.000);而与生理盐水组比较阿帕替尼组损伤区新生血管的长度和厚度明显减少,其中低剂量阿帕替尼组长度为(164.99±8.24)μm、厚度为(62.68±3.81)μm,高剂量阿帕替尼组长度为(81.16±6.53)μm、为厚度(25.58±4.02)μm,与生理盐水组比较差异均具有统计学意义(P=0.000);且高剂量阿帕替尼组与低剂量阿帕替尼组比较差异有统计学意义(P=0.000)。结论:阿帕替尼对激光诱导的小鼠CNV具有一定的抑制作用。第二部分:阿帕替尼对HRMEC增殖、迁移、管腔形成的影响及其分子机制的研究目的:探讨阿帕替尼对HRMEC的增殖、迁移、管腔形成的影响及其分子机制。方法:体外培养HRMEC,实验分组:对照组、rhVEGF诱导组、rhVEGF+5μM阿帕替尼组和rhVEGF+1μM阿帕替尼组。分别予以上述不同的干预后,检测各组细胞的增殖、迁移及管腔形成情况;Western blotting检测阿帕替尼对细胞p-VEGFR2、VEGFR2、ZO-1以及Occludin表达水平的影响。结果:(1)阿帕替尼抑制rhVEGF诱导的HRMEC增殖活性:CCK-8实验表明,与对照组比较,随着阿帕替尼浓度的增加,细胞增殖活性逐渐降低,分别为0.05μM(96.8%)、0.1μM(84.5%)、0.2μM(74.2%)、0.4μM(63.5%)、0.8μM(56.0%)、1.6μM(45.5%)、3.2μM(42.0%)、6.4μM(35.6%),因此,阿帕替尼可以一定程度上抑制rhVEGF诱导的HRMEC增殖活性,并呈剂量依赖性(P0.05)。(2)迁移实验显示,迁移细胞数量组间总体差异有统计学意义(F=119.30;P=0.000);与对照组细胞迁移数量(64.00±5.57个)相比,rhVEGF组细胞迁移数量(97.00±4.35个)显著增加(P=0.000);在rhVEGF诱导的同时加入高低剂量的阿帕替尼后,在rhVEGF+5μM阿帕替尼组细胞迁移数量为(32.00±4.00个),rhVEGF+1μM阿帕替尼组细胞迁移数量为(44.67±3.51个),其中与rhVEGF组比较,rhVEGF+1μM阿帕替尼组细胞迁移数量显著减少(P=0.000),且rhVEGF+5μM阿帕替尼组比rhVEGF+1μM阿帕替尼组抑制细胞迁移的数量更明显(P=0.035)。(3)阿帕替尼抑制HRMEC闭合管腔的形成:管腔形成实验结果显示,各组间总体比较差异有统计学意义(F=112.10;P=0.000);与对照组中闭合的管腔数量(10.33±0.58)个/孔相比,rhVEGF诱导组的管腔形成数量(17.00±1.00个/孔)明显增加,差异有统计学意义(P=0.000);在加入rhVEGF诱导的同时加入阿帕替尼干预后,在rhVEGF+5μM阿帕替尼组管腔形成数量为(4.00±1.00)个/孔,rhVEGF+1μM阿帕替尼组管腔形成数量为(7.00±1.00)个/孔,与rhVEGF组比较rhVEGF+阿帕替尼组两组管腔形成数量均显著减少(P=0.000),其中rhVEGF+5μM阿帕替尼组比rhVEGF+1μM阿帕替尼组抑制管腔形成的数量更明显(P=0.016)。(4)阿帕替尼抑制HRMEC中VEGFR2和p-VEGFR2的表达,促进紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达:Western blot结果显示,对照组VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为 0.29±0.02、0.28±0.02、0.29±0.02、0.23±0.01;rhVEGF 刺激组 VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为:0.52±0.04、0.56±0.04、0.11±0.003和0.08±0.002;低剂量阿帕替尼处理组VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为:0.26±0.02、0.20±0.002、0.54±0.02、0.41±0.02;高剂量阿帕替尼处理组 VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1 和 Occludin 灰度值分别为:0.17±0.01、0.06±0.004、0.54±0.02、0.61± 0.04。四种蛋白间总体比较结果显示:VEGFR2(F=110.35;P=0.001)、p-VEGFR(F=274.98;P=0.000)、ZO-1(F=556.74;P=0.000)和 Occludin(F=338.49;P=0.000);与对照组相比,rhVEGF刺激后的细胞组VEGFR2(P=0.001)和p-VEGFR2(P=0.000)增加;而紧密连接蛋白ZO-1(P=0.000)和Occludin(P=0.000)表达水平均降低;而加阿帕替尼干预后,与rhVEGF组比较,VEGFR2(P=0.000)和p-VEGFR2(P=0.000)表达均下降;而紧密连接蛋白ZO-1(P=0.000)和Occludin(P=0.000)表达水平均增加。结论:阿帕替尼可以抑制HRMEC的增殖、迁移及管腔形成,并抑制VEGFR2、p-VEGFR2的表达,但促进ZO-1和Occludin表达。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R774

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