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《扬州大学》 2017年
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黄瓜涝胁迫下不定根形成的组学及主效QTL ARN6.1精细定位与克隆研究

许学文  
【摘要】:黄瓜(Cucumis sativusL.,2n=2x=14)为葫芦科甜瓜属一年生攀缘性草本植物,是我国露地和设施栽培的主要蔬菜作物之一。随着全球气候变暖和雨涝灾害的频繁发生,涝已成为危害作物生长的重要制约因子。黄瓜根系具有入土浅、通气组织不发达、吸收力弱、再生能力差等特点,极易受到涝胁迫危害,造成产量损失和品质下降。因此,探明黄瓜对涝胁迫的遗传与适应机制,分离鉴定耐涝关键基因,创新耐涝种质和选育耐涝品种,对生产优质高产黄瓜具有重要理论意义和应用价值。选择精确可信且能够稳定遗传的表型是定位耐涝基因及解析耐涝机制的关键。前期通过对大量不同生态类型的黄瓜遗传资源耐涝性鉴定,筛选出耐涝品系Zaoer-N(华南型)和不耐涝品系Pepino(美国露地型)。对这两个品系连续多年淹涝观察均发现Zaoer-N的下胚轴形成不定根能力强,而Pepino下胚轴上基本没有或者只有极少量的不定根的形成。不定根是植物对淹涝胁迫最重要的适应能力之一,它代替了由于淹涝导致的原生根死亡,有利于受涝器官获得氧气。本文以Zaoer-N和Pepino为材料,利用RNA-seq比较了两者下胚轴淹涝48h后全基因组在转录水平上的差异表达基因;利用iTRAQ技术比较了两者下胚轴淹涝48h后的差异表达蛋白;以不定根数(Adventitious Root Numbers,ARN)为表型,进行耐涝性遗传分析及QTL初步定位,通过双亲重测序开发KASP标记鉴定大群体F2的重组株,精细定位了主效QTLARN6.1并对目标基因进行了图位克隆及功能鉴定;主要研究结果如下:1、RNA-seq共检测到27,000个转录本,Zaoer-N在淹涝48 h与对照间共有1,494个差异基因(FDR≤0.05,Fold changes≥2),而Pepino在淹涝48h与对照间共有1,766个差异基因。通过生物信息学比较分析发现与碳水化合物利用(Carbohydrate mobilization),硝酸盐吸收(Nitrate assimilation),激素合成及信号转导(Hormone production and signaling pathways),转录因子(Transcription factors),细胞分化(Cell division)等相关的基因可能与涝胁迫下黄瓜不定根原基形成能力密切相关。2、利用iTRAQ技术鉴定到具有定量信息的蛋白5,508个,其中差异表达(FDR≤0.05、Fold changes≥2)蛋白146个;43个蛋白在双亲间表达趋势一致,主要为胁迫响应蛋白、氧化还原酶、亚铁血红素等;47个蛋白仅在Zaoer-N中被检测到,主要为过氧化物酶、糖酵解/糖质新生相关蛋白;56个蛋白只在Pepino中被检测到,主要为碳水化合物分解蛋白和水解酶类;Zaoer-N下胚轴中差异蛋白与其对应转录本间的相关系数为0.26,Pepino下胚轴中差异蛋白与其对应转录本间的相关系数为0.18,均为显著相关(p≤0.05,2-tailed)。3、通过主基因+多基因混合遗传模型分析法对基于淹涝胁迫下的下胚轴不定根数进行了遗传分析。结果表明:不定根数的最适遗传模型为D-4模型,即1对加性-显性(相反)主基因+加性-显性多基因模型。主基因与多基因加性效应值均为正值,多基因显性效应值也为正值,黄瓜不定根数遗传主要由主基因的加性和多基因的加性-显性效应控制。4、利用来源于黄瓜全基因序列的1,335对SSR引物,对亲本进行差异多态性筛选,得到155对多态性引物,多态率为11.6%;构建了一张含有7个连锁群、149个SSR标记、平均遗传距离为3.7 cM的遗传图谱,每个连锁群与黄瓜染色体一一对应。采用复合区间作图法,共检测到3个与涝胁迫条件下不定根数相关的QTLs,分别命名为ARN3.1、ARN5.1和ARN6.1;三个季节的重复检测表明,仅位于Chr6上的主效QTLARN6.1在三个季节中均被重复检测到,可解释表型变异率分别为17.6%、24.0%和19.8%。5、依据对949株F2淹涝后不定根数的表型统计,选出50株不定根数最多(ARN40)的单株和50株不定根数最少(ARN≤5)的单株分别组成两个极端混池,用 SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)法进行简化基因组测序。对两个混池间通过测序所获得的SNP分别计算△(SNP_indeX)和AEuclidean distance并进行拟合回归分析,最终获得一个与主效QTLARRN6.1重合的关联区间,并将ARN6.1缩短至~310 kb的区间。使用该区间的两侧翼标记,从2,274株大F2群体中鉴定到了 33个重组株。利用双亲重测序结果,在区间内增加了 11个KASP标记以鉴定重组株基因型,结合重组株的ARN表型值,将ARN6.1精细定位至~61.5 kb的区间内,使用FGENESH软件预测到12个候选基因。分析这12个基因的转录组数据发现,仅Csa65G504460在淹涝48h后的Zaoer-N下胚轴中显著上调表达。qRT-PCR验证结果表明:Zaoer-N下胚轴在淹涝处理24 h、36 h、48 h后Csa6G504460的相对表达量均显著高于对照,而Pepino中该基因在处理与对照间各个时间点均无显著差异;综上,我们将该基因确定为候选基因。6、经 BLASTn 分析,Csa6G504460 编码 AAA-ATPase(ATPase associated with various cellular activities)蛋白,在植物体内具有结合并水解ATP的功能;序列比对发现双亲间该基因编码区共有三个SNP,但仅位于cDNA第1,519 bp(N端)处的 SNP 为非同义突变(Zaoer-N:GA1519T/Asp,Pepino:GG1519 T/Gly);序列保守结构域分析发现该非同义突变位于Csa6G504460蛋白的卷曲螺旋结构域内;对三十份黄瓜自交系淹涝后ARN表型与序列多态性的关联分析表明:该非同义SNP的多态性能够决定不定根表型;亚细胞定位结果表明:Csa6G504460蛋白主要分布于细胞质中,内质网中亦有少量分布;等位基因重组蛋白体外诱导、纯化及ATPase活力测定结果表明:Csa6G504460Asp蛋白具有较强ATPase活力且水解ATP能力与蛋白酶(底物)剂量间具有正相关性,而Csa6G504460Gly蛋白则基本丧失了水解ATP的能力;进一步研究发现:涝胁迫条件下,抑制Zaoer-N下胚轴内ATPase酶活力将导致其不定根形成能力丧失,而促进Csa6G504460Asp表达则可诱导更多不定根形成;异源过量表达35S::Csa6G504460Asp导致拟南芥(T3代)种子萌发后主根生长速度显著快于野生型(Col-0)株系,且侧根形成时间更早,表明该基因具有调控根发育的能力。
【关键词】:黄瓜 涝胁迫 不定根数 主效QTLARN6.1 精细定位 克隆 功能分析
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S642.2;S422
【目录】:
  • 摘要4-7
  • Abstract7-14
  • 符号说明14-16
  • 第一章 文献综述16-33
  • 1.1 涝害的严重性16
  • 1.2 淹涝的危害16-21
  • 1.2.1 淹涝对根系活力的影响17
  • 1.2.2 淹涝胁迫对作物细胞膜的影响17
  • 1.2.3 淹涝胁迫对光合作用的影响17-18
  • 1.2.4 淹涝胁迫对呼吸作用的影响18
  • 1.2.5 淹涝胁迫对植物激素的影响18-21
  • 1.2.5.1 乙烯19-20
  • 1.2.5.2 脱落酸20
  • 1.2.5.3 生长素20
  • 1.2.5.4 赤霉素20-21
  • 1.2.5.5 水杨酸与茉莉酸21
  • 1.3 作物的耐涝机制21-26
  • 1.3.1 形态解剖适应性22-24
  • 1.3.1.1 不定根22-23
  • 1.3.1.2 通气组织23
  • 1.3.1.3 径向氧损失屏障23
  • 1.3.1.4 顶端组织伸长23-24
  • 1.3.2 生理生化适应性24-26
  • 1.3.2.1 淹涝诱导硝酸盐呼吸代谢24
  • 1.3.2.2 淹涝诱导非共生性血红蛋白的形成24-25
  • 1.3.2.3 淹涝诱导脯氨酸积累25
  • 1.3.2.4 淹涝诱导多胺积累25-26
  • 1.4 作物的耐涝性的遗传及改良26-30
  • 1.4.1 耐涝性遗传26-27
  • 1.4.2 耐涝QTL定位27-28
  • 1.4.3 耐涝QTL图位克隆及功能解析28-29
  • 1.4.4 利用基因工程的遗传改良29-30
  • 1.5 黄瓜耐涝研究现状30-32
  • 1.5.1 黄瓜受涝症状30
  • 1.5.2 黄瓜种质耐涝性鉴定30-31
  • 1.5.3 黄瓜耐涝生理、生化研究31
  • 1.5.4 黄瓜耐涝QTL定位31-32
  • 1.6 研究目的意义32-33
  • 第二章 涝胁迫条件下不定根形成的转录组分析33-50
  • 2.1 材料与方法33-38
  • 2.1.1 植物材料及处理33
  • 2.1.2 总RNA提取33-34
  • 2.1.3 RNA样品检测、文库构建及质控34-35
  • 2.1.4 测序35
  • 2.1.5 生物信息学分析35-36
  • 2.1.6 qRT-PCR36-37
  • 2.1.7 基因表达差异的分析方法37
  • 2.1.8 乙烯释放量测定37-38
  • 2.1.9 内源ABA含量测定38
  • 2.2 结果分析38-43
  • 2.2.1 不定根原基形成观察38-39
  • 2.2.2 RNA-seq数据分析39-41
  • 2.2.3 差异基因功能分类41-42
  • 2.2.4 转录因子相关基因42-43
  • 2.3 讨论43-50
  • 第三章 涝胁迫条件下不定根形成的蛋白组分析50-64
  • 3.1 材料与方法50-54
  • 3.1.1 植物材料及处理50-51
  • 3.1.2 总蛋白提取51
  • 3.1.3 蛋白质Bradford定量51
  • 3.1.4 SDS电泳51-52
  • 3.1.5 蛋白质酶解与iTRAQ标记52
  • 3.1.6 SCX柱分离52
  • 3.1.7 LC-ESI-MSMS分析52-53
  • 3.1.8 肽段、蛋白质鉴定及分析53
  • 3.1.9 qRT-PCR53
  • 3.1.10 生理指标测定53
  • 3.1.11 内源茉莉酸含量测定53-54
  • 3.2 结果分析54-61
  • 3.2.1 淹涝胁迫差异表达蛋白筛选54-55
  • 3.2.2 差异蛋白功能分类55-58
  • 3.2.3 蛋白互作分析58-59
  • 3.2.4 淹涝导致相关生理指标的变化59-60
  • 3.2.5 iTRAQ与RNA-seq相关性分析60-61
  • 3.3 讨论61-64
  • 第四章 涝胁迫条件下不定根数的遗传及QTL定位64-78
  • 4.1 材料与方法64-68
  • 4.1.1 试验材料64
  • 4.1.2 淹涝处理及不定根统计64-65
  • 4.1.3 遗传效应分析65
  • 4.1.4 遗传图谱构建65-68
  • 4.1.4.1 DNA提取65-66
  • 4.1.4.2 SSR分子标记66
  • 4.1.4.3 PCR扩增66-67
  • 4.1.4.4 聚丙烯酰胺凝胶检测67
  • 4.1.4.5 银染67
  • 4.1.4.6 带型统计67-68
  • 4.1.4.7 遗传图谱构建68
  • 4.1.4.8 QTL定位68
  • 4.2 结果分析68-75
  • 4.2.1 淹涝后各世代下胚轴不定根数的次数分布68-70
  • 4.2.2 候选模型选择与适合性检验70-72
  • 4.2.3 最适模型下的遗传参数估计72-73
  • 4.2.4 SSR遗传图谱构建及QTL检测73-75
  • 4.3 讨论75-78
  • 第五章 涝胁迫条件下不定根数主效QTLARN6.1的精细定位及候选基因功能解析78-100
  • 5.1 材料与方法78-85
  • 5.1.1 试验材料78-79
  • 5.1.2 淹涝处理及不定根统计79
  • 5.1.3 混合群体分离分析法(BSA)简化基因组测序79
  • 5.1.4 SNP index关联分析79-80
  • 5.1.5 ED关联分析80
  • 5.1.6 双亲重测序80
  • 5.1.7 dCAPs标记开发及多态性鉴定80-81
  • 5.1.8 候选基因功能注释81
  • 5.1.9 候选基因的亚细胞定位81-82
  • 5.1.10 候选基因的原核表达及ATPase酶活力测定82-83
  • 5.1.11 候选基因的表达载体构建及拟南芥转化83-85
  • 5.1.12 转基因植株表型观察85
  • 5.2 结果分析85-97
  • 5.2.1 基于SLAF-seq的涝胁迫下不定根主效QTL鉴定85-87
  • 5.2.2 重组株鉴定及精细定位87-89
  • 5.2.3 候选基因确定89-92
  • 5.2.4 Csa6G504460分子生物学特征鉴定92-94
  • 5.2.5 ATPase与不定根形成之间的关系94-96
  • 5.2.6 Csa6G504460的转基因功能验证96-97
  • 5.3 讨论97-100
  • 全文结论100-101
  • 参考文献101-117
  • 致谢117-118
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文118-120

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