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《扬州大学》 2017年
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奶牛链球菌型乳腺炎乳腺组织基因表达与microRNA分析及miR-122对EPO和JAK-STAT通路靶向调控

蒲俊华  
【摘要】:奶牛乳腺炎是奶牛最常见的高发疾病,造成严重的经济损失,长期困扰世界奶牛业发展。奶牛乳腺炎主要由病原菌侵入乳腺组织而造成乳腺内的感染,链球菌即是其中主要的致病菌之一。链球菌属革兰氏阳性菌,呈球形或卵圆形,多数呈链状或成对生长。无乳链球菌在奶牛乳腺的感染率可达11%-43%,感染后奶牛乳腺的自愈率较低。尽管抗生素是目前治疗乳腺炎的有效手段,但无乳链球菌对青霉素G、阿莫西林、氨苄青霉素等的耐药率已达50%-100%。解决这一问题需要深入研究病原菌的致病机理和机体免疫应答机制,为寻找新的防控乳腺炎的方法提供理论基础。microRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的单链非编码RNA,miRNA可调控超过60%的编码蛋白基因,涉及细胞的生长、增殖、凋亡及免疫调控等生命活动过程。利用miRNA表达的特异性,寻找乳腺组织在炎症免疫应答过程中差异表达的miRNAs,有助于从分子水平上了解机体免疫应答的机理,为防控乳腺炎提供新的思路。本研究通过人工诱导方式建立奶牛无乳链球菌型乳腺炎模型,采用Affymetrix牛全基因组芯片技术获得链球菌型乳腺炎乳腺组织的差异表达基因,筛选与免疫相关的通路。同时采用Solexa高通量深度测序技术构建两组小RNA文库,分析链球菌组差异表达的miRNAs,对miRNAs的预测靶基因进行GO和KEGG分析。综合分析结果,确定进一步研究miR-122是否通过靶向EPO而调控JAK-STAT通路。将miR-122在乳腺上皮细胞过表达和抑制表达后,采用实时荧光定量技术检测其对靶基因EPO及其JAK-STAT通路的相关基因EPOR、JAK2、STAT5A、STAT5B、Bcl-2表达的影响,再用双荧光素酶报告基因系统验证miR-122对EPO3'UTR的靶向调控作用。本研究得到的结果如下:(1)奶牛链球菌型乳腺炎模型的建立链球菌人工诱24h后,试验乳区出现明显的乳腺炎临床症状:红肿、发热,触痛,产奶量减少,奶中有絮状物,SCC急剧上升,超过200万个/mL。石蜡组织切片显示病理变化:乳腺组织结构松散,乳腺间质发生水肿,细胞间连接空隙增大,乳腺上皮细胞萎缩,腺泡腔变大,乳腺腔内可见脱落的乳腺上皮细胞、多形核中性粒细胞、巨噬细胞等聚集。结合临床症状表现和实验室指标检测结果确定构建奶牛链球菌型乳腺炎成功。(2)奶牛链球菌型乳腺炎乳腺组织基因表达特征Affymetrix基因芯片结果显示共有差异表达显著基因136个,包括78个表达上调基因和58个表达下调基因。在这些基因中,18个表达上调的基因CD34,SDC4,CDH5、APLNR,HTR2B、ACTN2、CACNA1A、CD55、DCP1A、ELMO1、GALNTL4、GAN01、HTR2B、LOC514818、NOTCH2、VWF、PROS1、ITGB4 和 11 个表达下调的基因EPO、CYPEF3、ABCA12、CCL17、LIPG、JAG1、RPS15、TAF4B、C4BPB、XRCC3、FST富集到38条通路,其中与免疫相关的通路有13条,如JAK-STAT、细胞因子与因子受体作用、造血细胞谱系通路、Notch信号通路等。(3)奶牛链球菌型乳腺炎组织的miRNA表达谱分析miRNA表达谱分析显示,链球菌组和对照组分别得到18,535,913和20,847,000条干净序列。链球菌组共有373个的已知和399个新的miRNA,对照组有358个已知和232个新的miRNA。差异表达显著的miRNA共35个,其中表达上调miRNA10个(miR-122、miR-223、miR-16a、miR-2284k、miR-2484、miR-451、miR-383、miR-486、miR-2332、miR-326),表达下调 miRNA25 个(miR-378b、miR-145、miR-136、miR-26a、miR-33a、miR-335、miR-3660、miR-146a和miR-206等)。35个差异表达miRNAs共预测到18,801个靶基因,靶基因位点数82,832。GO分析表明预测靶基因的分子功能涉及生物过程的主要富集在刺激应答、信号、生物调节过程、细胞死亡、免疫过程上;涉及分子功能的主要富集在结合和转导上。KEGG分析显示其主要富集于与免疫相关的通路如RIG-样受体信号通路、细胞质DNA感受通路、Notch信号通路等。(4)miR-122靶向EPO3'UTR的验证EPO为miR-122的预测靶基因,利用pmiR-RB-REPORTTMVector成功构建出EPO 3'UTR野生型载体和突变型载体,与miR-122mimic共转染293T细胞,利用双荧光素酶报告基因系统证实miR-122与EPO 3'UTR存在作用靶位点(ACACTCC),表明miR-122靶向调控EPO的表达。(5)奶牛原代乳腺上皮细胞的培养及转染条件确定纯化的奶牛原代乳腺上皮细胞,聚集成岛屿状生长,具有典型的铺路石和鹅卵石形状,细胞生长曲线呈“S”形,符合一般细胞生长的规律。实时荧光定量法检测到乳腺上皮细胞成功表达β酪蛋白mRNA,表明此方法获得的乳腺上皮细胞可用于后续的实验研究。经不同转染浓度与转染试剂用量的组合试验,最终确定细胞转染条件为转染浓度1OOnM,转染试剂1μL(96孔板)。(6)miR-122过表达和抑制表达对EPO及JAK-STAT通路基因表达影响将miR-122mimic转染入奶牛乳腺上皮细胞48h后,miR-122表达量显著升高,显著降低EPO表达量,JAK-STAT通路基因中EPOR、JAK2、STAT5A、STAT5B和Bcl-2的表达量均下调,且Bcl-2下调显著。miR-122 inhibitor转染入奶牛乳腺上皮细胞48h后,EPO、EPOR、JAK2、STAT5A表达量上调、STAT5B表达量显著上调。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S858.23

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【参考文献】
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