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《扬州大学》 2018年
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传染性支气管炎病毒拮抗宿主干扰素作用的分子机制研究

余丽萍  
【摘要】:传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)属于冠状病毒科冠状病毒属中的γ冠状病毒。已有研究表明,多种α冠状病毒和β冠状病毒编码的木瓜样蛋白酶(papain-like proteases,PLP)具有去泛素化酶(deubiquitination,DUB)活性,病毒通过 DUB活性拮抗宿主干扰素系统,逃避宿主的抗病毒免疫反应。IBV编码的PLP是否具有DUB活性及其分子机制仍有待阐明。临床上IBV与H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)混合感染可导致鸡群发病率及死亡率升高,我们推测IBV对宿主干扰素的拮抗有利于IBV与H9亚型AIV的复制,进而产生协同致病作用。1.IBV编码的木瓜样蛋白酶具有去泛素化酶活性泛素和去泛素化修饰在Ⅰ型干扰素信号通路中起重要调节作用。宿主模式识别受体的活化及天然免疫反应细胞信号的传递都需要泛素化修饰的介导。本研究对IBV编码的PLP是否具有DUB活性,以及发挥DUB活性的关键区域进行了分析。DF1细胞感染IBV后,转染泛素修饰分子,发现IBV对Ub、Ub-K48及Ub-K63连接的多聚泛素化修饰均表现出明显的DUB活性,且其DUB活性具有时间依赖性。病毒感染早期,其DUB活性明显强于病毒感染晚期。IBV Ck/CH/JS/2010/12株基因组4243~5553位核酸序列编码PLP,通过软件预测其下游5781~6252位核酸序列编码跨膜结构域(transmembrane,TM),为此构建了 PLP和包含跨膜结构域的PLP(PLP-TM)真核表达质粒。分别与泛素分子共转染DF1细胞,发现PLP-TM具有明显的DUB活性,能够去除细胞中蛋白的泛素化修饰,同时对Ub-K48及Ub-K63连接的多聚泛素化修饰也具有DUB活性,但是PLP没有DUB活性,表明跨膜结构域在PLP-TM的DUB活性中发挥关键作用。我们进一步利用定点突变方法,将与PLP-TM蛋白酶活性相关的氨基酸位点C1274和H1437分别突变为丝氨酸和赖氨酸。将突变体及PLP-TM分别与泛素分子共转染DF1细胞,发现PLP-TM的DUB活性受到微弱影响,但仍然表现出明显的DUB活性,表明PLP-TM的DUB活性不完全依赖于蛋白酶催化活性。2。IBV感染早期抑制干扰素表达黑色素瘤分化相关基因-5(Melanoma differentiation associated gene-5,MDA5)是宿主细胞识别IBV的主要模式识别受体,与视黄酸诱导基因蛋白-Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene Ⅰ,RIG-Ⅰ)同属于RIG-Ⅰ样受体(RLRs)家族。MDA5与RIG-Ⅰ借助其N端的CARD结构域与其下游定位于线粒体表面接头蛋白(Mitochondrial antiviralsignaling gene,MAVS)的Caspase 募集结构域(Caspase activation and recruitment domains,CARD)相互作用,诱导MAVS活化。活化的MAVS募集下游的干扰素调节因子3/7(Interferon regulatory factor 3/7,IRF3/7)及核转录因子κB(NF-κB),诱导Ⅰ型干扰素表达。IBV拮抗宿主干扰素的表达与MDA5及MAVS是否相关,仍有待研究。由于鸡体内缺少RIG-Ⅰ基因,又促使我们去研究IBV抑制干扰素的表达是否与RIG-Ⅰ基因的缺失相关。本研究用IBV感染CEK细胞,发现病毒感染早期(感染后12 h)chIFN-β转录水平低于对照组,36 h后开始升高,60 h达到高峰,48 h到72 h之间chIFN-β转录水平均显著高于对照组,chIFN-λ及chMx的表达规律与chIFN-β基本一致;IBV感染DF1细胞后,转染MDA5特异性刺激剂poly(I:C),结果发现IBV在感染早期(感染后12 h)抑制polyI:C诱导的IFN-β表达,表明IBV对宿主干扰素的拮抗作用主要发生于感染早期。我们还构建了鸡MDA5(chMDA5)及鹅RIG-Ⅰ(dgRIG-Ⅰ)真核表达质粒,将其转染DF1细胞后,发现过表达chMDA5及dgRIG-Ⅰ均能上调IBV诱导的chIFN-β转录水平,而IBV的复制水平没有受到影响;IBV感染早期,诱导宿主细胞MAVS裂解,感染后24 h,裂解效应有所降低。本研究还发现,通过siRNA抑制chMDA5或chMAVS表达,IBV感染细胞的chIFN-β转录水平降低;同时抑制chMDA5、chTLR3和chMAVS,抑制IBV感染细胞的chIFN-β转录效果最明显。结果表明,IBV感染早期通过裂解MAVS阻断MDA5信号通路,抑制机体干扰素表达。3.IBV与H9亚型AIV协同致病机制研究本研究从IBV拮抗宿主干扰素表达的角度,探索IBV与H9亚型AIV的协同致病机制。以IBV与H9亚型AIV混合感染SPF鸡胚,胚体发生卷曲,矮小化,发育不良,皮下组织严重充血、出血,表皮组织有大量的出血斑块;尿囊液、气管、肺脏及肠道组织中H9亚型AIV的载量显著高于单独感染组;接种病毒后12 h,IBV感染组及混合感染组干扰素表达水平均低于对照组;48h到72h混合感染组气管、肺脏及肠道组织IFN-α、IFN-β、IL-1β及IL-13转录水平显著高于单独感染组。以IBV与H9亚型AIV混合感染SPF鸡,混合感染组接种病毒后第3天,出现严重的呼吸道症状,第7天开始,发病鸡群陆续出现死亡;混合感染组、H9亚型AIV感染组及IBV感染组鸡群存活率分别为80%、95%及90%;混合感染组鸡的气管、肺脏及肠道组织IFN-α、IFN-β、IL-1β及IL-13转录水平高于单独感染组。以上结果表明,IBV感染早期抑制干扰素的表达,促进H9亚型AIV的复制,随着病毒复制水平的升高,炎症因子表达水平随之增高,形成细胞因子风暴,造成更严重的组织损伤。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.65

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