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《扬州大学》 2018年
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基于ipaJ基因鉴定鸡白痢沙门菌PCR方法的建立及IpaJ抑制宿主NF-κB信号通路机制的研究

徐黎娟  
【摘要】:鸡白痢沙门菌(Salmonellaenterica serovar Gallinarum biovar Pullorum,S.Pullorum)是引起鸡白痢的病原菌,具有高度宿主专一性。鸡白痢沙门菌多侵害20日龄以内雏鸡,引起白色下痢,发病率和死亡率极高;成年鸡感染后可带菌而无明显的临床症状,既可水平传播,又有严重的垂直传播。在中国和其他一些发展中国家,鸡白痢的爆发给禽类养殖业造成了巨大的经济损失。因此,建立快速检测鸡白痢沙门菌的方法对于有效地防治鸡白痢具有重要意义;同时,对鸡白痢沙门菌效应蛋白功能的鉴定有助于揭示其致病机理,为鸡白痢的防治提供新见解。1.基于ipaJ基因鉴定鸡白痢沙门菌PCR方法的建立传统的沙门菌鉴定方法依赖于生化反应和血清型鉴定,在操作得当的情况下,这种方法能对沙门菌进行正确的分型,但是非常耗时。在本研究中,我们通过靶向鸡白痢沙门菌中特有的pSPI12质粒上的ipaJ基因,从而建立了一步法鉴定鸡白痢沙门菌的PCR方法。对从1962年到2016年间分离的650株鸡白痢沙门菌进行检测发现,644株都携带特异性的ipaJ基因。其中六株细菌鉴定为ipaJ阴性,通过对其全基因组序列进行分析,我们发现这六株细菌中不存在pSPI12质粒,因此造成ipaJ阴性的结果与PCR的特异性无关。本研究建立的PCR方法特异性很高,不会和其他血清型的沙门菌产生交叉反应,尤其是和鸡白痢沙门菌在遗传进化上亲缘关系很近的鸡伤寒沙门菌(Salmonellaenterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum,S Gallinarum)。这意味着该 PCR 方法可以直接区分鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌,而不需要通过复杂的生化鉴定。该方法的检测限为90 fg/μL或102CFU/μL。此外,该方法适用于鉴定从鸡场分离出的疑似样本,得到的结果和用传统的血清型鉴定以及生化鉴定结果一致。这些结果都表明该PCR方法适用于鸡白痢沙门菌的快速鉴定。2.IpaJ蛋白抑制宿主NF-κB信号通路机制的研究沙门菌的效应蛋白在调控宿主信号转导及细胞过程中发挥非常重要的作用。本研究中,我们发现IpaJ作为鸡白痢沙门菌特有的蛋白,能够抑制TNFα、LPS以及IL-1β诱导的宿主细胞内NF-κB信号通路的活化。同时,IpaJ蛋白在细菌感染宿主期间也发挥抑制NF-κB信号通路的作用。90位半胱氨酸(C)、230位组氨酸(H)和242位天冬氨酸(D)作为IpaJ蛋白的催化活性中心,对其功能的发挥有着决定性影响。90位C、230位H或242位D突变成丙氨酸后,IpaJ蛋白会失去抑制NF-κB信号通路活化的能力。和pSPI12质粒缺失株相比,野生株感染宿主细胞后能够明显抑制TNFα诱导的IκB的降解,使胞内IκB含量始终保持稳定水平。IpaJ并不抑制IκB的磷酸化,因此磷酸化的IκB含量和IκB总量始终保持一致。进一步研究表明,IpaJ蛋白通过抑制IκB泛素-蛋白酶体途径降解,从而抑制NF-κB信号通路的活化。通过激光共聚焦显微镜观察发现,IpaJ蛋白可以抑制p65向细胞核内转移,从而抑制相关基因的转录和表达,最终导致细胞培养上清中IL-8、IL-1β、IL-6等炎性因子分泌水平的降低。通过比较发现,虽然鸡白痢沙门菌IpaJ蛋白和福氏志贺菌(Shigellafexneri,S.flexneri)IpaJ蛋白在200个氨基酸内只有49%的相似性,但是福氏志贺菌分泌的IpaJ蛋白也能够抑制NF-κB信号通路的活化;鸡白痢沙门菌中的IpaJ蛋白和福氏志贺菌IpaJ一样,可以使高尔基体出现破碎化。此外,在鸡白痢沙门菌中SPI1和SPI2的缺失并不影响IpaJ蛋白的表达和分泌,说明在鸡白痢沙门菌中,IpaJ蛋白的表达和分泌不受T3SS的调控。IpaJ蛋白是鸡白痢沙门菌中第一个被揭示具有抑制NF-κB 信号通路的效应蛋白,对其功能的进一步研究将有助于理解其致病机理。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.61

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>殷俊磊
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