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H7N9亚型禽流感病毒感染宿主引起IP-10表达差异的机制研究

宋可可  
【摘要】:H7N9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是一种新出现的人兽共患的病原,自从2013年在我国报道以来,已在我国人群中形成了五波流行高峰,其中包括618例死亡病例,病死率高达40%。早期的遗传进化分析结果表明,H7N9亚型AIV是家鸭源H7N3、鸡源H10N9和家禽源H9N2的三元重配病毒,其中内部基因均来源于2010年以来一直为优势基因型的H9N2病毒。人感染H7N9的流行高峰和流行地点与家禽感染H7N9的流行特点颇为相似,进一步证实了人源H7N9与禽源H7N9病毒的高度同源性。感染H7N9病例的高死亡率往往与细胞因子风暴引起的肺损伤有关,其中部分促炎因子和趋化因子可以作为其急性感染和组织损失严重程度的分子标记,包括IP-10(γ干扰素诱导蛋白-10)。H7N9的系统发育和临床特征是明确的,但其在不同宿主(如哺乳动物)中高致病性的潜在分子机制仍然未知。因此,深入研究并揭示H7N9 AIVs对哺乳动物的致病性,对于H7N9AIVs对养殖业及公共卫生影响的预警预报具有重要意义。本研究分析了鼠致病性差异的毒株诱导IP-10表达水平,以及IP-10表达水平对其致病性的影响;在A549细胞上分析模式病毒引起IP-10表达差异的关键聚合酶蛋白。1.趋化因子IP-10对H7N9 AIVs鼠致病性的影响从不同致病性和不同来源的13株H7N9 AIVs中,我们选择对鼠低致病的JTC4及其鼠适应株JTC4M11作为模式病毒,测定其EID50、TICD50、生长曲线,BABL/c小鼠攻毒实验测定其体重变化和死亡情况。基因组差异分析发现2株病毒全基因组仅存在6个氨基酸差异;在MDCK细胞上均能有效复制,滴度均可达到约7 log10TCID50/0.1mL;其鸡胚半数感染量相似,约为8 log10EID50/0.1mL。BABL/c小鼠攻毒实验结果表明,JTC4M11和JTC4对小鼠是分别为高致病性的(MLD50=102.68 EID50)和低致病性的(MLD50106.5 EID50);在感染后的第 3天,JTC4M11组小鼠体重显著下降,小鼠肺组织出现明显的水肿,炎性细胞浸润;JTC4M11组肺组织病毒载量明显要高约为5.67 log10TCID50/mg(JTC4病毒载量为1.93 log10TCID50/mg);IP-10表达水平上升400倍,有显著差异。IP-10滴鼻实验表明:JTC4M11+IP-10组体重下降明显,对小鼠的致死性均显著增强,在感染后72 h-84 h时,JTC4M11+IP-10组死亡率高达57%(4/7),不加IP-10的JTC4M11组死亡率约14.3%(1/7),说明IP-10对JTC4M11的致病性有协同作用。但是A549细胞感染JTC4和JTC4M11后表达IP-10没有明显差异,说明小鼠和人源细胞在病毒感染后表达趋化因子IP-10存在差异。2.聚合酶蛋白对H7N9 AIVs诱导A549细胞IP-10表达水平的影响为了进一步研究H7N9病毒人兽共患的病毒方面的分子机制,我们选用A549细胞为研究模型,从上一章的H7N9 AIVs中筛选出2株IP-10表达有显著差异的病毒JTC4和SDL124作为模式病毒。基因组差异分析发现全基因组存在24个氨基酸差异,主要位于聚合酶蛋白:PB2、PB1和PA(14个),其次为膜蛋白:HA和NA(9个);2株病毒可以在MDCK细胞上有效复制,SDL124要比JTC4复制能力稍强,最高滴度约5 log10TCID50/mL;在A549细胞上,SDL124要比JTC4复制能力弱,其滴度从24 h开始基本稳定在2.5 log10TCID50/mL。为了分析聚合酶基因PB2/PB1/PA对IP-10表达的影响,以JTC4为骨架构建了聚合酶蛋白单基因替换构建重组病毒:rJTC4-SDL124PB2、rJTC4-SDL124PB1、rJTC4-SDL124PA。将拯救成功的重组病毒感染A549细胞,通过荧光定量PCR检测IP-10转录水平,结果显示,rJTC4-SDL124PB2病毒感染A549时,与JTC4相比其IP-10表达显著降低(P0.05),其他单个基因替换的重组病毒IP-10表达水平与母本毒株JTC4无显著差异。本研究通过小鼠实验证实鼠致病性差异的毒株诱导产生IP-10水平不同,且IP-10与鼠适应株JTC4M11具有协同致病性;在A549细胞上,不同致病性的毒株诱导细胞IP-10转录水平不同,决定模式病毒诱导IP-10转录水平差异的决定因素是病毒的PB2蛋白。


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