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磁性介孔硅纳米探针的构建及其在新城疫病毒检测中的研究

李真真  
【摘要】:新城疫(Newcastle disease,ND)也称为亚洲鸡瘟或伪鸡瘟,是由新城疫病毒(Newcastle disease Virus,NDV)引起的一种急性、热性和高度接触性禽传染病。新城疫主要特征为呼吸困难、神经症状及浆膜和黏膜出血。近年来,检测NDV的方法不断更新,但规模化养殖模式需要更灵敏或更快捷的检测技术检测NDV的早期感染,以便更好地防控NDV。传统的NDV检测方法主要包括病原的分离与培养鉴定、PCR(Polymerase chain reaction)、LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)及 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)等技术。这些检测技术各有其优缺点:病原学诊断方法为检测NDV的金标准,但检测时间长、成本高。PCR技术灵敏度高,但需要对样品进行核酸提取,对实验人员技术要求高,样品易污染。LAMP是一种等温扩增技术,但其扩增效率低,灵敏度与PCR相差甚远,还没有被广泛认可。ELISA是用酶联抗体与底物放大信号的技术,灵敏度较高,易于进行大批量样本检测,但由于其需要几步孵育,检测时间比较长,但仍有提升空间,非特异性吸附难以避免导致重复性差,在实验室检测抗原时需要多次优化条件。磁性介孔二氧化硅纳米颗粒(Magnetic mesoporous silica nanoparticles,M-MSNs)具有许多突出的优点,如大的孔隙体积(高达2.5 cm3/g)、高比表面积(1000 m2/g)、可调控孔径大小、可功能化、高的化学和生物稳定性以及良好的生物兼容性等,被广泛应用于生物检测、传感及载药体系。本研究,利用介孔二氧化硅的可装载性及可修饰性,制备了一种磁性介孔二氧化硅纳米免疫探针,替代ELISA技术中的一抗孵育及酶标二抗孵育两步试验步骤,构建了一种基于具有载酶磁性介孔二氧化硅纳米免疫探针。简述如下:选择粒径约60 nm、孔径约5 nm的磁性介孔二氧化硅纳米颗粒,将分子量为44 kDa的过氧化物酶(Peroxidase,POD)通过扩散作用使其进入M-MSNs的介孔中,随后在M-MSNs表面包裹一层阳离子聚合物聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)使POD分子驻留在M-MSNs孔内,无法渗出。最后利用DNA修饰抗体(负电性的DNA修饰抗体从而增加抗体的负电性)与包覆了 M-MSNs表面的PEI通过静电吸附制得M-MSNs纳米免疫探针。DNA功能化的抗体是通过点击化学将单链DNA与NDV抗体以“一对一”形式耦连。使用SDS-PAGE电泳、热重分析、DLS分析及透射电镜等方法对纳米探针进行分析验证,结果表明:此载酶介孔二氧化硅纳米免疫探针的介孔中成功装载了约400个POD分子,并且该纳米探针成功的使用PEI对介孔结构进行“包封”防止了 POD的渗出。通过SDS-PAGE以及纳米探针表面的电位变化情况可以得知成功的将DNA功能化的抗体修饰在纳米探针表面,且每个纳米颗粒表面约有200个抗体分子。随后将探针存放在4℃中两个月,考察探针中的酶活稳定性结果表明:磁性介孔二氧化硅纳米探针POD的活性保持稳定,探针无酶泄漏。这表明,载酶介孔二氧化硅免疫纳米探针构建成功。我们采用本研究构建的磁性介孔二氧化硅纳米探针检测经纯化的NDV样品,结果显示该探针具有特异性,检测灵敏度达到了 102 PFU/100 μL,同时使用传统的ELISA方法检测平行实验,对比灵敏度和检测时间,在检测体系构建过程中,利用PCR方法验证探针法检测结果的准确性和一致性,通过透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)表征验证载酶介孔二氧化硅纳米免疫探针捕获病毒的结果。最后使用本文构建的磁性介孔二氧化硅纳米探针ELISA法检测了感染NDV的禽的泄殖腔棉拭子样品;通过已建立的检测体系进行测定,同时采用传统ELISA方法验证结果,结果发现本研究中构建的载酶介孔硅免疫探针的法的灵敏度比传统ELISA提高了 10倍,同时与ELISA相比检测时间缩短,证明该方法可用于实际检测。综上所述,该研究成功构建了一种基于载酶介孔二氧化硅纳米免疫探针的新型检测技术,此技术比传统的ELISA技术灵敏10倍,对比传统ELISA法检测时间缩短。此技术有望替代传统的ELISA方法,被广泛应用于各个生物实验室和检测中心。


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