癸氧喹酯纳米脂质体的制备及抗鸡球虫效果研究

【摘要】：鸡球虫病(Chicken coccidiosis)是由艾美耳球虫引起的以肠道病变为主的寄生虫病,多发生于雏鸡,由于鸡只发病后主要造成肠道损伤、采食量下降,导致生产性能降低,机体消瘦甚至死亡,给养禽业带来严重危害,同时,球虫耐药性的产生也给该病的防治带来新的挑战。癸氧喹酯(Decoquinate,DQ)是用于预防鸡球虫感染的喹啉类化学抗球虫药,具有高效、安全等优点,其抗球虫效果与药物颗粒大小有关,但DQ颗粒较大、不溶于水,造成使用不便、药物吸收利用度低等缺点,因此,将其做成水溶性纳米脂质体具有重要的临床意义。1癸氧喹酯纳米脂质体(DQNL)的制备首先,寻找合适的溶剂使DQ、蛋黄卵磷脂及胆固醇充分溶解,为此对比了多种溶剂,如乙醇、氯代正丁烷、乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷等,根据溶解度确定三氯甲烷:甲醇(1:1)作溶解剂。由于DQ具有极强的亲脂疏水特性,故选择薄膜分散-超声法制备DQNL初样,然后对DQNL的制备条件进行优化。试验过程中DQ的含量使用HPLC检测,通过8个浓度梯度DQ标准品相应的吸收峰值,建立标准曲线方程Y=132653x-60368,R2=0.9997,经验证其方法学符合相关要求。优化试验的单因素试验设置了脂药比、膜材比、水浴温度及超声时间四个考察因素,每因素5个梯度,以包封率和载药量为指标,筛选出对指标影响较大的因素。根据单因素试验结果使用Minitab设计成四因素三水平L9(34)正交优化试验,以包封率为评价指标,分析得出最优组合配比。正交试验结果分析表明DQNL的最佳制备条件为:蛋黄卵磷脂:药物(w/w)为10:1;蛋黄卵磷脂:胆固醇(w/w)比为5:1;旋转蒸发温度为50℃;超声持续时间为15 min。2 DQNL的表征在此基础上对DQNL的结构、粒径以及稳定性等进行表征。HPLC法检测最优条件下制备的DQNL平均包封率达98.94%,载药量达6.91%;透射电镜观察DQNL的微观形态,显示DQNL具有脂质体的特征结构;纳米粒度分析仪测定DQNL的平均粒径为115.6nm,多分散指数为0.175,Zeta电位为-39.1 mV,表明DQNL粒径达纳米级别,分布均匀且粒子间稳定;将DQNL置于4℃环境中,每隔7d取样进行粒度分析,经28d测试结果显示DQNL粒径仅增加了 1.9nm,Zeta电位的绝对值降低了 3.9mV,表明DQNL在4℃储存时具有较高的稳定性。3 DQNL抗柔嫩艾美耳球虫作用评价选取对地克珠利(Dic)耐药的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)临床分离株口服接种制备球虫病模型进行本试验:将84只12日龄雏鸡按体重分为空白对照组(Blank Control,Con)、球虫模型组(E.tenella-infected,EI)、DQ 原药组(EI+40mg/kg DQ,DQ40)、DQNL 组,分别为高(EI+20mg/LDQNL,DQNL20)、中(EI+10mg/LDQNL,DQNL10)、低(EI+5 mg/LDQNL,DQNL5)剂量组,Dic 对照组(EI+2μL/LDic,Dic2),共 7组,每组12只,适应三天接种球虫卵囊,后饲养一周,期间密切观察鸡只的精神状态及粪便情况。第八天称重采样,通过粪便记分、相对增重率、病变值、卵囊值及抗球虫指数(ACI)等评价抗球虫效果。结果得出DQNL5组与DQ40组的ACI相当,表明DQNL显著提高了 DQ的疗效,且可饮水使用。随后进行了 DQNL体外抑制球虫孢子生殖试验:将9组不同剂量的DQNL分别加入到新鲜分离的未孢子化球虫卵囊中,在统一条件下进行孢子生殖,72h后计数并计算卵囊的孢子化率,结果表明5mg/L及其以上浓度均可显著降低卵囊的孢子化率,并呈现明显的剂量依赖性。4 DQNL冻干保护剂筛选为进一步方便DQNL的储存和使用,对DQNL的冷冻干燥工艺进行初步探讨,即冻干保护剂的筛选。相同浓度的DQNL中加入不同类型的冻干保护剂,如糖类、盐类、酸类、聚合物等,然后进行冷冻干燥,通过考察冻干粉的颜色外观,复溶时溶液再分散的快慢及粒径大小,验证各类冻干保护剂对DQNL的保护作用。结果表明糖类化合物在DQNL冻干时具有明显的保护作用,方便了 DQNL储存和后续研究。结论:采用薄膜分散-超声法制备的DQNL平均粒径为115.6nm,粒径较小,分布均匀,可与水互溶,其抗球虫功效比DQ原粉明显增强;4℃避光条件下存放28 d仍稳定,糖类冻干保护剂对DQNL有明显的冻干保护作用。