收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用

孙兰  
【摘要】:H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)自首次分离至今,已在全世界各地造成了广泛的传播。在国内,H9N2亚型AIV呈地方性流行且传播范围广,不但给养殖业造成巨大的经济损失,也给公共卫生安全造成潜在的威胁。在免疫压力和抗原漂移作用下,AIV容易发生抗原变异,最终导致免疫失败。因此研发针对H9N2亚型AIV较为理想的单抗对H9亚型AIV监测和诊断有重要的意义。1.H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达选取 H9N2 AIV 流行株 A/Chicken/Taixing/10/2010(简称 rTX)和疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98(简称F98)作为研究对象,通过PCR分别扩增其HA基因和NP基因,将其克隆到真核表达载体PCAGGS上,成功构建出重组质粒PCAGGS-rTX-HA、PCAGGS-F98-HA 和 PCAGGS-rTX-NP。然后将其转染入 293T 细胞,通过间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和蛋白印迹试验(Western blot,WB)检测确定HA和NP蛋白均在体外正确表达,成功制备出用于制备单克隆抗体的免疫原。此外,通过将PCAGGS-rTX-NP进行双酶切获得的NP片段连接pET-32a上,构建原核重组质粒pET32a-rTX-NP,利用Roestta(DE3)进行优化表达,获得分子量约为73 KD的可溶性rNP,以作为下一步制备针对rTX毒株NP蛋白单克隆抗体的筛选原。2.H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用将重组质粒PCAGGS-rTX-HA和PCAGGS-F98-HA通过肌肉注射结合基因导入仪刺激的方式免疫6-8周龄BALB/c小鼠,三免后腹腔注射灭活病毒进行加强免疫,3天后取其脾细胞制备杂交瘤细胞。通过血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)试验和IFA对融合孔进行筛选,经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,其中有4株为针对rTX HA蛋白的单抗,分别命名为1B9、1C10、3E2和2D6;有2株为针对F98 HA蛋白的单抗,分别命名为1B2和1F10。抗体亚类鉴定结果显示,1B9、1C10和3E2的亚类均为IgM,2D6的亚类为IgG2a,1B2和1F10的亚类为IgG1;6株单抗腹水HI效价较高,均在210-215之间;IFA检测结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98产生特异性荧光,其余的单抗对毒株rTX产生特异性荧光;Western-blot试验结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98有特异性反应,其余的单抗都对毒株rTX有特异性反应,条带大小均为75KD;中和试验结果显示,单抗2D6、1B2和1F10都具有中和特性,其中1F10的中和效价最高;单抗特异性和广谱性鉴定结果显示,6株抗HA蛋白单抗只与H9亚型AIV有反应,而与其他亚型AIV和NDV无反应性,表明具有良好的特异性,其中有4株单抗对H9N2 AIV的反应谱较好;6株单抗对2017-2019年实验室分离株HI和IFA检测结果显示,有37.1%(10/27)的H9N2 AIV分离株与4株抗Y280-like代表株HA蛋白的单抗所识别的表位存在抗原差异性,有22.26%(6/27)的H9N2 AIV分离株获得了与抗F98毒株HA蛋白单抗识别表位类似的抗原位点。因此,这些单抗可用于流行株的抗原差异性分析,且近3年的流行株已发生了较大的抗原变异。3.H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备和鉴定将重组质粒PCAGGS-rTX-NP免疫小鼠进行单克隆抗体的制备。细胞融合10 d后,通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和EFA筛选阳性杂交瘤细胞。经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,分别命名为1B4、1E50、2E10、3A9、8F10和3E6。抗体亚类鉴定结果显示,2E10、3A9和1B4的亚类均为IgG2a,1E50的亚类为IgG1,3E6和8F10的亚类为IgM;采用ELISA试验对单抗腹水效价进行检测,效价在1:25600-1:204800之间;IFA试验结果表明6株单抗中只有3E6和8F10与rTX毒株有特异性的荧光反应;特异性试验结果表明单抗3E6、8F10、2E10和1B4这4株单抗不与NDV和IBV发生反应,具有良好的的特异性,单抗3A9和1E50的特异性不佳;广谱性鉴定结果表明单抗3E6、8F10和2E10的广谱性较好,除了不与H5N1亚型发生反应,与H9N2、H5N6和H7亚型的AIV都有很好的反应,而单抗1B4、3A9和1E50广谱性较差,只与部分H9N2亚型AIV和毒株W1-8(H7亚型)反应。综上所述,单抗3E6、8F10和2E10综合特性较好,在AIV流行病学调查等方面有一定的应用价值。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前19条
1 程冰花;王爱华;刁有祥;李川川;张英;张璐;杨国平;赵丹丹;;25株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传进化分析[J];中国兽医学报;2016年06期
2 曹维伟;陈杰;张燕霞;黄保续;洪军;陈德坤;李晓成;;H9N2亚型禽流感病毒陕西分离株的鉴定及HA、NP、NA全序列测定[J];中国动物检疫;2006年01期
3 张民秀;谢芝勋;黄莉;谢志勤;刘加波;谢丽基;邓显文;罗思思;黄娇玲;;H9N2亚型禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达[J];基因组学与应用生物学;2017年03期
4 陈瑞玲;钟颖;邓颖琦;丁壮;丛彦龙;;表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白重组乳酸杆菌的构建[J];中国兽医学报;2015年12期
5 陈俊霞;孙鹏;许书珍;李思菲;苏帅;赵鹏;崔治中;;H9N2亚型禽流感病毒HA基因的表达及其单因子血清的制备[J];中国畜牧兽医;2015年11期
6 赵翔玥;张二芹;许倩茹;马凡舒;王雅楠;牛香香;李雪洋;张申立;张同旭;邓瑞广;张以芳;张改平;;禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白在水稻胚乳中的稳定、高效表达及活性鉴定[J];华北农学报;2020年04期
7 屈素洁;施开创;邹联斌;胡杰;张步娴;粟艳琼;梁媛;尹彦文;李军;莫胜兰;;2011~2014年广西H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传变异分析[J];畜牧与兽医;2016年03期
8 范春艳;汪秀会;宋金祥;薛素琴;孙惠霞;唐争魁;马兴树;乔健;;2株鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒HA基因序列分析[J];中国家禽;2020年02期
9 侯力嘉;吴胜昔;梁望旺;曾政;鲁友铭;石雨莲;张娇;王桂玲;马培杰;;H9N2禽流感病毒HA蛋白的原核表达与鉴定[J];黑龙江畜牧兽医;2020年10期
10 黄政;欧新华;袁洁;刘晓蕾;;长沙市首例人感染H9N2禽流感病毒的HA基因序列特征分析[J];中国人兽共患病学报;2016年11期
11 王延树;李建丽;梁武;尤永君;杨保收;邹立宏;刘浩;;13株H9N2亚型禽流感病毒HA基因变异分析[J];中国家禽;2011年15期
12 武利利;刁有祥;鞠小军;于春梅;崔京腾;;山东地区16株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析[J];病毒学报;2012年03期
13 韩春华;林健;刘月焕;潘洁;马明;刘永宏;;北京3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析[J];安徽农业科学;2009年10期
14 唐志芬,贾永清,王君伟,孙进华,管雪婷,高宏丽;禽流感病毒H9N2亚型分离株HA基因的克隆及序列分析[J];畜牧与兽医;2004年12期
15 刘红旗,张评浒,刘秀梵,刘文博,贾立军,彭大新 ,程坚;封闭式饲养鸡场H9N2亚型禽流感病毒HA基因在5年内的遗传变异[J];微生物学报;2003年06期
16 陈陆;刘守川;赵军;王川庆;王泽霖;;不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析[J];中国农业科学;2011年24期
17 宋才良;廖志宏;沈勇;王焕;李鸿鑫;蔺文成;陈伟国;张新珩;谢青梅;;2018-2019年广东地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传进化分析[J];中国兽医学报;2020年10期
18 陈顺艳;廖昌韬;曾凡桂;严专强;苏晓娜;廖秋生;覃健萍;陈峰;;2011年-2014年我国部分省区H9N2亚型禽流感病毒HA基因序列分析[J];动物医学进展;2016年02期
19 汪艳玲;刘林飞;赵怀荣;王民生;;江苏地区7株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析[J];职业与健康;2015年17期
中国重要会议论文全文数据库 前20条
1 李颖;杨桂连;王春凤;;H9N2亚型禽流感病毒HA基因的克隆及其在乳酸菌中的表达[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(下册)[C];2010年
2 王泽霖;刘守川;陈少渠;陈恩林;;不同H9N2亚型禽流感病毒HA表面抗原变异的研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
3 王金良;董林;李书光;魏凤;杨慧;沈志强;;同一地区不同年代的3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因差异分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
4 魏亚鹏;王新卫;杨霞;郭会娟;张美玲;赵军;陈陆;常洪涛;姚惠霞;王川庆;;2010-2012年中国中部地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传进化分析[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年
5 黄欣梅;李银;刘宇卓;赵冬敏;杨婧;韩凯凯;;17株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传分析[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2015年
6 王金良;沈志强;李峰;刘吉山;;3株相隔5到10年的H9N2亚型禽流感病毒HA基因差异分析[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
7 王金良;沈志强;李峰;刘吉山;管宇;曲光刚;唐娜;;3株不同年代H9N2亚型禽流感病毒HA基因差异分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
8 王金良;沈志强;李峰;刘吉山;;3株相隔5到10年的H9N2亚型禽流感病毒HA基因差异分析[A];山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第一次学术研讨会论文集[C];2009年
9 白斯伟;吴志强;覃健萍;陈峰;毕英佐;谢青梅;;中国南方地区H9N2亚型禽流感病毒2002-2009年分离毒株HA基因功能进化分析[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(下册)[C];2010年
10 王建琳;张毅;王守春;徐守振;尹燕博;;H9N2亚型禽流感病毒致病性特点及HA基因分子流行病学研究[A];2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会论文集[C];2012年
11 韩庆功;乔传玲;杨焕良;陈艳;辛晓光;陈化兰;赵玉军;;H9N2亚型猪流感病毒HA基因的克隆及体外表达[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会第六届代表大会论文集[C];2006年
12 刘东;李娟;顾敏;刘秀梵;;华东地区2013-2015年H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传进化分析[A];第四届全国禽病分子生物技术青年工作者会议论文集[C];2015年
13 尹燕博;张毅;于明科;李明义;徐守振;王建琳;李吉达;许江涛;刘兴彩;孙婷婷;郭妍妍;韩丽敏;;H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白氨基酸差异与病毒抗原性差异的相关性研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
14 王延树;李建丽;杨保收;尤永君;邹立宏;刘浩;;H9N2亚型禽流感病毒分离株的HA基因分子进化分析[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
15 程冰花;王爱华;刁有祥;李川川;;25株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传进化分析[A];第三届水禽疫病防控研讨会论文集[C];2015年
16 张毅;尹燕博;王建琳;于明科;李明义;韩丽敏;崔尚金;陈桂来;;47株H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白基因流行演化规律的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
17 陈瑞爱;赖汉漳;贺东生;唐兆新;李琳;刘玉鹏;张文炎;;20株鸡源H9N2亚型禽流感病毒HA基因的变异分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2012年
18 王泽霖;刘守川;陈少渠;陈恩林;;单抗介导的HI试验对不同H9N2亚型禽流感病毒HA表面抗原变异的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
19 王泽霖;王川庆;赵军;王新卫;陈陆;郑鹿平;;H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异毒株的致病性、抗原性、免疫原性研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2012年
20 韩庆功;乔传玲;杨焕良;陈艳;辛晓光;丁选亚;陈化兰;;猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前20条
1 张传美;H9N2亚型禽流感病毒感染水貂的研究[D];中国农业大学;2016年
2 李曦;中国大陆H9N2亚型禽流感病毒遗传演化关系的研究[D];中国农业科学院;2002年
3 李银;禽流感病毒H9N2鸭分离株的生物学与分子生物学特性及其快速诊断的研究[D];南京农业大学;2006年
4 朱光剑;中国南方H9N2禽流感病毒的分子进化分析及其对小鼠致病性研究[D];华东师范大学;2012年
5 冯强;H9N2亚型流感病毒HA基因变异分析及对鸡免疫机能的影响[D];山东农业大学;2010年
6 平继辉;H9N2亚型禽流感病毒抗原变异及感染哺乳动物分子机制的研究[D];南京农业大学;2008年
7 黄艳艳;我国部分地区鸡源H9N2亚型AIV的系统进化和HA抗原分析以及AIV NA分型方法的研究[D];四川农业大学;2010年
8 彭广能;虎源H_5N_1亚型流感病毒HA基因与NP基因核酸疫苗和重组腺病毒活载体疫苗的实验研究[D];四川农业大学;2010年
9 胥韦;H5N1禽流感病毒HA蛋白的免疫损伤致病机制研究[D];广州医学院;2009年
10 万志敏;抗体压下H9N2流感病毒囊膜糖蛋白关键抗原表位氨基酸的变异分析[D];扬州大学;2015年
11 徐大伟;H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究及疫苗的初步研制[D];内蒙古农业大学;2012年
12 张坤;豚鼠抗流感病毒相关因子研究及H9N2亚型禽流感病毒致病力分析[D];北京协和医学院;2013年
13 刘旭东;H9N2重组病株药物分子动力学与代谢核心研究[D];大连理工大学;2012年
14 胡思顺;禽流感病毒H9N2亚型和鸡毒霉形体HS株主要抗原性基因的克隆与表达研究[D];华中农业大学;2005年
15 李慧;现代汉语“V_单+NP”语块研究[D];北京语言大学;2008年
16 褚军;鹦鹉热衣原体感染加重鸡H9N2亚型禽流感发病的机制研究[D];中国农业大学;2017年
17 刘佳旭;应用反向遗传操作系统研究鹅源新城疫病毒NP基因5'非编码区六个核苷酸对病毒毒力的影响[D];吉林大学;2015年
18 索朗斯珠;H9N2亚型禽流感病毒及新城疫病毒西藏分离株的生物学特性研究[D];华中农业大学;2011年
19 吕静;H9N2亚型禽流感病毒气源性传染的监测及其分子机制的研究[D];山东农业大学;2012年
20 魏延迪;H9N2 亚型禽流感病毒抗原性变异及其冷适应疫苗交互免疫机制研究[D];中国农业大学;2016年
中国硕士学位论文全文数据库 前20条
1 孙兰;H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用[D];扬州大学;2020年
2 范钊;H9N2禽流感病毒核蛋白NP单克隆抗体的制备与鉴定[D];东北农业大学;2013年
3 彭成成;H9N2亚型禽流感病毒纯化和病毒HA蛋白定量方法的建立及初步应用[D];华东理工大学;2019年
4 刘娟;H9N2亚型禽流感病毒抗原性及其与HA基因变异的相关性研究[D];山东农业大学;2013年
5 段旭彤;H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的抗原变异及受体结合特性分析[D];黑龙江大学;2017年
6 任义品;H9N2亚型禽流感病毒的分离及其HA基因的遗传变异分析[D];西北农林科技大学;2014年
7 张瑶瑶;H9N2亚型禽流感病毒HA基因真核和原核表达及其单因子血清的制备[D];山东农业大学;2013年
8 娄本红;抗体选择压作用下H9N2亚型禽流感病毒HA基因的变异[D];山东农业大学;2009年
9 顾家英;H9N2亚型禽流感病毒抗原变异株单抗的制备及其在抗原变异机制研究中的应用[D];扬州大学;2016年
10 李珊珊;载H9N2禽流感病毒HA基因质粒LDH@SiO_2壳-核纳米粒的制备及其免疫效果[D];黑龙江大学;2018年
11 李珊珊;载H9N2禽流感病毒HA基因质粒LDH@SiO_2壳-核纳米粒的制备及其免疫效果[D];黑龙江大学;2018年
12 卢秀娴;2014~2017年我国部分地区H9N2禽流感病毒HA和NA基因分析及免疫效力评估[D];华南农业大学;2017年
13 温肖会;H9N2禽流感病毒的分离鉴定及其HA和NA基因的遗传变异研究[D];西北农林科技大学;2009年
14 潘文宝胜;H9N2广西分离株HA基因序列分析及越南与中国学生H9亚型抗体水平检测[D];广西医科大学;2012年
15 万晓朋;中国大陆H9N2亚型禽流感病毒遗传演化分析及疫苗株的选择[D];中国农业科学院;2010年
16 刘伊;H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其在抗原变异机制中的研究[D];扬州大学;2015年
17 申伟霞;H9N2亚型禽流感病毒遗传演化分析及细胞灭活苗初步研制[D];山西农业大学;2014年
18 李林;H9N2亚型禽流感病毒进化分析及哺乳动物感染实验研究[D];吉林农业大学;2011年
19 徐丹雯;H9N2亚型禽流感病毒的序列分析及其生物学特性研究[D];扬州大学;2016年
20 王爱华;H9N2亚型禽流感病毒在种鹅中垂直传播及其致病性研究[D];山东农业大学;2016年
中国重要报纸全文数据库 前20条
1 导报综合;我国攻克禽流感病毒变异难关[N];医药导报;2007年
2 本报记者 王静;禽流感传播罪魁:家禽还是候鸟[N];中国科学报;2012年
3 记者 赵路;第二篇禽流感病毒争议论文发表[N];中国科学报;2012年
4 本报记者 张佳星;禽流感病毒传播竟然也划“圈子”[N];科技日报;2020年
5 赵熙熙;美重启争议性禽流感病毒实验[N];中国科学报;2019年
6 王方 编译;亚洲马为何不怕禽流感[N];中国科学报;2019年
7 本报记者 周映夏 通讯员 黄海航;注意防控禽流感和流感[N];中山日报;2019年
8 刁有祥;规模化鸭场禽流感的防控措施[N];河北科技报;2017年
9 本报记者 董碧水;杭州全面防控禽流感 禽蛋业遭受打击[N];中国青年报;2013年
10 记者 王梦婕 实习生 谢宛霏;北京进入防控禽流感应急状态[N];中国青年报;2013年
11 本报记者 刘坤喆;泰国每个省都有一位“禽流感先生”[N];中国青年报;2008年
12 本报记者 王波;人和人会传染禽流感吗[N];中国青年报;2008年
13 本报记者 张伟;与禽流感病毒赛跑[N];中国青年报;2009年
14 本报记者 彭溢;降伏禽流感的科技尖兵[N];黑龙江日报;2018年
15 记者 李大庆;H5N6禽流感病毒基因起源和进化机制破解[N];科技日报;2016年
16 北京商报记者 陶凤 初晓彤;圣诞遇上禽流感 法国鹅肝告急[N];北京商报;2016年
17 本报记者 李颖;我国尚未发现H5N6,但应警惕H7N9[N];科技日报;2017年
18 本报记者 罗晖;H7N9禽流感病毒尚不会造成大范围传播[N];科技日报;2017年
19 记者 唐梦霞 通讯员 张雪海 江歆;我省关闭各县活禽交易市场[N];浙江日报;2017年
20 记者 慈玉鹏;与流感“共舞”[N];北京科技报;2017年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978