来氟米特诱导NSC34细胞自噬促进SOD1突变蛋白降解的作用机制及其对ALS小鼠干预效果的初步研究

【摘要】：肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)俗称“渐冻症”,是一种以脊髓前角、脑干运动核团和大脑皮层运动神经元损害为特征的神经退行性疾病。目前已知多种致病基因,中国人中散发性和家族性ALS患者的运动神经元内往往携带突变的铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn Superoxide dismutase 1,SOD1)基因,最常见的是突变蛋白SOD1G93A聚集物积累,进而导致运动神经元死亡,目前尚无有效治疗方法。自噬是真核细胞所特有的细胞内物质成分被溶酶体降解过程的统称,是生物在其发育、老化过程中普遍存在的净化自身错误折叠蛋白质或受损细胞器的共同机制。细胞自噬受到多种信号通路的调控,经典的调控途径包括JAK-STAT信号通路、MAPK-JNK通路和PI3K-AKT-mTOR通路。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是哺乳类细胞中MAPK(mitogen-activated protein kinase,丝裂原活化蛋白激酶)信号通路的下游应答分子。JNK信号通路在细胞分化、自噬、凋亡和应激中具有重要作用。此前的研究已证明:抗类风湿性关节炎药来氟米特及其活性代谢物N-[4-(三氟甲基)苯基]-2-氰基-3-羟基-2-丁烯酰胺(A77 1726)能够通过抑制S6K1激活TAK1来诱导自噬的发生,并进一步降解SOD1G93A突变蛋白聚集物。近期我们发现,A77 1726能够磷酸化激活TAK1下游的JNK,但对于JNK在A77 1726诱导的自噬中所发挥的作用尚不明确。因此我们设想,来氟米特及其活性代谢产物A77 1726能够通过磷酸化激活JNK来诱导细胞自噬,并且JNK在A77 1726诱导自噬清除SOD1G93A聚集物过程中发挥关键性作用。为验证假设,首先用A77 1726处理NSC34细胞,并对自噬相关蛋白进行Western blot 分析。结果显示,A77 1726 能够磷酸化激活 TAKS412、MKK4S257/T261、JNKT183/Y185、Beclin1S93、Bcl-2S70等MAPK-JNK信号通路相关蛋白,并提高自噬标志蛋白LC3II及自噬底物标志物p62表达水平,且A77 1726这种诱导作用与作用时间和剂量呈正相关。当干扰TAK1表达时,JNK、Beclin1的磷酸化水平以及自噬标志底物p62的表达都会受到抑制。该结果表明,上游信号分子TAK1能够调节A77 1726介导的JNK激活和自噬。为了进一步验证JNK在A77 1726诱导的细胞自噬中所发挥的作用,我们分别用了抑制剂SP600125和基因敲除法抑制了 NSC34细胞中的JNK基因表达,Western blot结果显示,A77 1726诱导的Bcl-2、Beclin1等的磷酸化水平随着JNK的抑制而降低,同时LC3Ⅱ和p62的表达量减少,自噬被阻断。共聚焦分析也显示,JNK被抑制后,胞浆内自噬小体的数量显著减少。上述结果表明,JNK在A77 1726诱导的自噬中发挥着至关重要的作用。然后,我们研究了JNK在A77 1726诱导自噬清除SOD1G93A聚集物中的作用。Western blot结果显示,在SOD1G93A组,A77 1726显著减少了积聚的SOD1G93A突变蛋白聚集物,但当加入JNK抑制剂SP600125或者当JNK基因被敲除时,这种清除作用则明显被抑制。为了更加直观清晰地反映JNK在A77 1726介导的SOD1G93A聚集物降解中的关键作用,我们用GFP-SOD1WT或SOD1G93A质粒转染细胞,再用SP600125和A77 1726进行处理。酶标仪及流式细胞仪分析显示,相比于未加药组,A77 1726显著减少了 SOD1G93A转染细胞的平均荧光强度。但当加入JNK抑制剂SP600125后,GFP-SOD1G93A转染细胞的平均荧光强度明显回升。以上实验结果表明,A77 1726能够通过磷酸化激活JNK来诱导细胞自噬,并且JNK在A77 1726诱导自噬清除SOD1G93A聚集物中发挥关键性作用。最后,我们应用肌萎缩侧索硬化转基因SOD1G93A小鼠为动物模型,给予其不同剂量来氟米特(5、10、20、30mg/kg body weight/day)短期干预一个月,通过对发病时间、病程的监测,初步评价来氟米特对延缓ALS发病、延长SOD1G93A小鼠存活等方面的效果。体内试验结果表明,灌服来氟米特(5mg/kg/day,10mg/kg/day)能够显著延长ALS模型小鼠的存活期。上述研究结果将为探索自噬调控对ALS病理的影响提供重要的体内外试验依据。