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LPS对MC3T3-E1细胞自噬和凋亡的影响及枸杞酰胺的保护作用

陈苗苗  
【摘要】:脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是构成革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一,可引起类风湿性关节炎、骨髓炎、创伤性关节炎等骨骼炎症性疾病。然而,LPS对成骨细胞自噬和凋亡的作用机制尚不明确。枸杞酰胺(aurantiamide acetate,AA)是地骨皮提取物的主要成分之一,具有抗炎和调节骨代谢的作用,但AA对成骨细胞的作用机制鲜有报道。因此,本研究以成骨细胞系MC3T3-E1为研究对象,通过茜素红染色、Western Blot、流式细胞术、透射电镜、高内涵细胞成像分析等技术,探究LPS对成骨细胞自噬和凋亡的影响及作用机制,并明确AA在其中的保护作用,为研发治疗骨骼炎症性疾病的新型药物提供理论依据。1 LPS对MC3T3-E1细胞自噬和凋亡的影响为了探究LPS对MC3T3-E1自噬和凋亡的影响,用1 μg/mL LPS作用MC3T3-E1不同时间(0、3、6、12和24h),或不同浓度(0、0.5、1和5μg/mL)LPS处理6h或21 d,采用茜素红染色观察矿化结节,Western Blot检测自噬和凋亡相关蛋白的表达,Hoechst 33258染色观察细胞核形态,流式细胞术检测凋亡率和线粒体膜电位。结果显示,矿化结节面积呈LPS剂量依赖性减小(P0.01);与对照组相比,ATG5、Beclin1和 LC3-Ⅱ 蛋白水平在 6、12、24h 显著升高(P0.05 或P0.01),ATG7、p62、BAX/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3 的蛋白水平在 3、6、12、24 h 显著升高(P0.05 或P0.01);0.5、1 和5μg/mLLPS处理 6h,ATG5、ATG7、LC3-Ⅱ、Beclin1、BAX/Bcl-2蛋白水平显著升高(P0.05或P0.01);1和5 μg/mL LPS处理6 h,p62蛋白水平显著升高(P0.05 或P0.01);Cleaved Caspase-9/Caspase-9 和 Cleaved Caspase-3/Caspase-3 的表达水平在1、5 μg/mL LPS处理6 h后极显著升高(P0.01)。Hoechst 33258染色发现,LPS处理组细胞核形态异常数目增多。流式细胞术结果显示,LPS处理3、6、12、24h后细胞早期和晚期凋亡率均极显著升高(P0.01);且不同浓度LPS处理,细胞凋亡率呈浓度依赖性提高(P0.01)。线粒体膜电位检测结果显示,1、5μg/mL LPS处理显著降低线粒体膜电位(P0.05或P0.01)。以上结果表明,LPS导致成骨细胞的自噬水平上升,促进细胞凋亡,抑制成骨细胞矿化。2 AMPK/mTOR/ULK1信号通路在LPS致MC3T3-E1细胞自噬和凋亡中的作用机制为了明确AMPK/mTOR/ULK 1信号通路在LPS致MC3T3-E1自噬和凋亡中的作用机制,Compound C(CC)预处理MC3T3-E1细胞1 h后添加LPS处理6 h,通过Western Blot检测AMPK/mTOR/ULK1信号通路、自噬和凋亡相关蛋白的表达水平,流式细胞术检测凋亡率。结果显示,与对照组相比,不同浓度(0.5、1、5 μg/mL)LPS处理MC3T3-E1细胞6h后p-AMPK/AMPK蛋白水平呈剂量依赖性升高(P0.01);p-AKT/AKT蛋白水平无统计学差异(P0.05);p-mTOR/mTOR蛋白水平极显著下降(P0.01);1、5μg/mLLPS处理后p-ULK1/ULK1蛋白水平显著升高(P0.05或P0.01)。与对照组相比,CC处理使p-AMPK/AMPK蛋白水平极显著下降(P0.01);与LPS组相比,LPS+CC 组 p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1、LC3-II 蛋白水平极显著降低(P0.01),p-mTOR/mTOR、BAX/Bcl-2蛋白水平显著升高(P0.05或P0.01),p62蛋白水平无显著变化(P0.05)。流式细胞术结果显示,与LPS组相比,LPS+CC组凋亡率极显著升高(P0.01)。以上结果表明,LPS通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路调控MTC3T3-E1自噬;CC抑制AMPK活性,降低LPS诱导的成骨细胞自噬水平,并且促进细胞凋亡。3枸杞酰胺对LPS致MC3T3-E1细胞自噬和凋亡的保护作用为了明确枸杞酰胺在LPS致MC3T3-E1自噬和凋亡中的保护作用,AA预处理MC3T3-E1细胞1 h,添加LPS处理6 h,采用高内涵细胞成像分析系统检测细胞增殖情况,茜素红染色观察细胞矿化结节形成,TEM观察细胞超微结构,Western Blot检测自噬、凋亡相关蛋白表达,Hoechst 33258染色观察细胞核形态,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,LPS和AA对MC3T3-E1细胞增殖无显著影响。与LPS组比较,LPS+AA组矿化结节面积极显著增加(P0.01)。TEM观察细胞超微结构发现,LPS组细胞核边缘内陷,双层膜结构的自噬小体数量较对照组增多,AA及LPS+AA组自噬小体和自噬溶酶体均增加。与LPS组相比,AA+LPS组p62、p-mTOR/mTOR、BAX/Bcl-2 蛋白水平显著下降(P0.05 或P0.01),Beclin1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 显著升高(P0.05 或P0.01)。MC3T3-E1 感染 GFP-RFP-LC3 慢病毒后,高内涵细胞成像分析系统对MC3T3-E1内LC3聚点追踪拍摄25 h,并对纯红色和黄色聚点数量进行分析统计,LPS组纯红点数总体呈下降趋势,AA和LPS+AA组纯红色荧光聚点数目呈上升趋势。对处理6h后的各组进行比较,与对照组相比,LPS极显著增加了平均每个细胞内的黄色聚点数量(P0.01);与LPS组相比,AA组平均每个细胞的黄点数极显著下降(P0.01),LPS+AA组显著降低(P0.05)。Hoechst 33258染色结果显示,与LPS组相比,AA预处理极显著降低了形态异常的细胞核(P0.01)。流式细胞术结果显示,AA预处理极显著降低LPS引起的凋亡率(P0.01)。以上结果表明,AA能够减轻LPS对MC3T3-E1细胞矿化的抑制作用,提高细胞自噬水平,减少LPS引起的自噬小体累积,促进自噬小体向自噬溶酶体转变,在LPS致MC3T3-E1自噬和凋亡中有一定的保护作用。


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