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具有寄主核定位特征的辣椒疫霉效应蛋白的预测、鉴定及应用初探

张烨  
【摘要】:由疫霉菌(Phytophthora spp.)造成的作物疫病是农业生产上的毁灭性病害,严重威胁着全球的生态和粮食安全,给世界经济造成了巨大的损失。由于疫霉菌与植物病原真菌在遗传学上的巨大差异,多数杀菌剂对之无效,目前尚无高效的防治手段。近年来随着转基因育种技术的发展,培育转基因抗性品种可为现阶段防治作物疫病、保障农业生产安全提供一种有效方案。已知植物病原细菌的核调控蛋白(nucleomodulins)可进入寄主的细胞核、调控植物防卫相关基因的表达,是一类非常重要的致病相关蛋白,但在卵菌中尚无系统研究。鉴于此,本文首次在辣椒疫霉(P.capsici)中开展了以下研究:(1)为了探究这类效应蛋白的分布,利用生物信息学技术预测辣椒疫霉中具有DNA结合功能域的外泌蛋白。结果共获得48个候选蛋白。(2)为了分析候选蛋白是否在辣椒疫霉的侵染过程中发挥作用,利用荧光实时定量RT-PCR技术,分析了这48个基因在辣椒疫霉生长发育和侵染阶段的转录水平。结果显示,预测的大多数基因(70.83%)在侵染阶段上调表达,说明这些效应蛋白响应了辣椒疫霉的侵染。(3)为进一步明确候选蛋白在侵染过程中的作用,克隆了两个在侵染阶段高量表达的基因(PcSep20与PcSpe43)并对其进行了更进一步的研究:(a)通过酵母蔗糖酶分泌实验证实PcSEP20与PcSEP43的信号肽具有引导蛋白外泌的功能;(b)通过激光共聚焦显微镜观察发现PcSEP20和PcSEP43均能进入寄主细胞核;(c)利用农杆菌介导的瞬时表达技术,分析效应蛋白在辣椒疫霉侵染过程中发挥的作用。结果发现,PcSEP20可以促进辣椒疫霉对本氏烟(Nicotiana benthamiana)的侵染,而PcSEP43却抑制辣椒疫霉的侵染。(4)利用农杆菌侵染构建稳定转PcSep43基因的本氏烟植株,发现稳定表达PcSep43的本氏烟可抵抗辣椒疫霉的侵染而几乎不发病,不仅进一步证实了 PcSEP43的表达可抑制辣椒疫霉的侵染,而且为植物抗疫病育种提供了抗性基因资源。本研究预测出辣椒疫霉中潜在的核调控蛋白,分析了这些蛋白编码基因在辣椒疫霉侵染和生长过程中的转录水平,分析了 PcSEP20和PcSEP43蛋白在辣椒疫霉侵染植物过程中发挥的作用。研究结果不仅为认识疫霉菌调控植物基因转录表达的机制提供了初步实验数据,也为培育抗疫病作物品种提供了重要的基因资源。


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