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《扬州大学》 1999年
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禽白血病病毒J亚群囊膜糖蛋白基因的生物学和生物化学特性

秦爱建  
【摘要】: J亚群禽白血病病毒(ALV—J)是90年代由英国鉴定出来的ALV新的亚 群,主要引起肉鸡的骨髓瘤白血病。ALV—J的囊膜蛋白决定病毒的表型和病毒 中和反应类型。本研究应用PCR的方法从感染了ALV—J美国分离株ADOL- 4817和ADOL—Hc1的DF1细胞中分别扩增出特异性囊膜基因(env),并克隆进 大肠杆菌TA载体,得到了相应env克隆的重组质粒TA—4817env和TA-Hc- env。对ADOL—4817 env基因进行定序分析表明,ADOL—4817株env基因大 小为1746b,经计算机分析可翻译成581个氨基酸的蛋白质,分子量为 64643daltons;经翻译后再加工的gp85和gp37由517个氨基酸组成,分子量为 57677 daltons。ADOL—4817 env蛋白质有15个潜在的糖基化位点,氨基酸序列 分析进一步表明,虽然在整个env与ALV—J原型毒株HPRS—103相比有一些 氨基酸的变异,但整个env基因表达的囊膜糖蛋白的结构特性如多肽前导序列、 表面结构域、穿膜结构域等都比较保守。然而,ADOL—4817env蛋白的C末端比 其它毒株多了13个氨基酸残基。不同ALV—J毒株的env基因比较结果表明, ADOL—4817与已发表的ALV—J其它毒株序列有很高的同源性,其中gp85的 同源性为88.3—95.1%,gp37的同源性为88.8—92.4%;但与ALV的A—E亚 群的同源性仅24.6—51.4%。 本研究构建了env基因杆状病毒转移性载体质粒PBac4817env和PBacHc— env,通过与载体杆状病毒Bac—N—blue的DNA在SF9细胞上进行共转染,经 筛选获得重组杆状病毒rBac4817env和rBacHc—env。免疫荧光试验(IFA)结果 证明,感染了这二株重组杆状病毒的Sf9细胞能够表达ALV-J的env基因产 物,主要蛋白质分子量大小约为90—94kDa。糖基化分析结果证明,重组env基因 产物是糖基化蛋白质,重组env基因产物对ADOL—Hc1感染的CEF有明显的抑 制作用。用表达的基因产物对鸡进行免疫,可以诱导鸡产生对ALV—J env蛋白的 特异性抗体。 本研究用重组杆状病毒表达的基因产物免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制 备出抗ALV—J囊膜糖蛋白的特异单隆抗体。试验结果证明,所获得的单抗G2, JE9和I45是抗ALV—J亚群特异性的单抗;另一株单抗J47则是对所有外源性 ALV(A、B、C、D和J)特异的单克隆抗体,对内源性E亚群不反应。用单抗JE9 对我国分离到的6株ALV—J感染的(CEF)鸡胚成纤维细胞作IFA时,来自病鸡 的二株呈强阳性,另二株呈弱阳性,还有二株为阴性。这表明,我国已存在着一些 在抗原性上与欧美流行毒株不完全相同的ALV刁野毒株。用单克隆抗体对感染 鸡组织中抗原的检测结果证明,单克隆抗体光 和GZ可以检测出感染鸡组织中 ALV—J抗原,并具特异性。对不同组织检测结果还证明,肾脏组织含毒量较高。 Tunicamycin的敏感性实验证明,90—94kDa蛋白质是 env基因产物的糖基 化形式,53kDa蛋白质可能是囊膜蛋白的非糖基化形式。用糖耷酶 PNGase F处 理a 细胞表达的env基因重组产物,原有的90—94kDa的蛋白质消失,产生出 分子量约 57kDa的蛋白质条带,提示 ALV—J env基因产物主要含有以能被 PNGase FN分解的 N一连接的糖基。Tunicamycin能显著降低ALV—J在感染 细胞中的病毒滴度,但病毒的囊膜蛋白基因仍然能够正常转录、转译和合成,只是 不能被糖基化,因而未糖基化的ALV—J病毒不能感染宿主细胞。免疫荧光试验 检测经Tunicamycin处理的病毒感染的细胞,结果呈现阴性反应,提示非糖基化 的囊膜蛋白不能被再加工,因而不能表达于感染细胞的表面。综述这些结果,糖基 化作用对ALV—J病毒的成熟和再感染十分重要。 在大肠杆茵中以GST $合蛋白的形式分别表达了ADOL4817株env的基因 的不同片段,它们与不同株单克隆抗体反应的结果证明,单抗拍 和GZ针对的抗 原表位位于 env蛋白 N一端第 65—155 %基酸区域,单抗 145所针对的抗原表位 位于第 157—233 #基酸区域。这是我们首次用实验证明了,ALV叶亚群的特异 性决定于多肽的氨基酸排列顺序,而与糖基化无直接关系。同时也是首次确立了 抗ALV—J的不同单抗所识别的表位的位丘。进一步用细茵表达的env基因片段 GSTat合蛋白制得的小白鼠抗血清与 ADOL—HCI和 ADOL—4817二株 ALV —J病毒进行中和试验表明,所有抗血清均不能完全中和 ADOL—H。1和 ADOL —4817对鸡胚成纤维细胞的感染作用,但抗 pGEX—TJM6—GST(能表达 env基 因的Vr3区)血清有一定程度的抗ADOL—4817$染CEF作用,统计分析差异显 著(P(0.001)。这一结果提示T env基因产物的 Vr3区域在 ALV—J的病毒中和 活性和干扰活性中起主要决定作用。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:1999
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前8条
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中国博士学位论文全文数据库 前2条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【参考文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前9条
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中国硕士学位论文全文数据库 前7条
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵冬敏;B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性[D];山东农业大学;2010年
2 张青婵;A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D];山东农业大学;2010年
3 孙亚妮;免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用[D];山东农业大学;2011年
4 邱玉玉;A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备和不同亚群禽白血病病毒共感染相互影响的研究[D];山东农业大学;2011年
5 邓小芸;网状内皮组织增生症病毒LAMP检测方法及感染性分子克隆的建立[D];东北农业大学;2011年
6 杨玉莹;J亚群禽白血病病毒内蒙株的分离鉴定及其部分分子生物学特性的研究[D];内蒙古农业大学;2003年
7 姜世金;Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的表达及序列测定与分析[D];中国农业大学;2003年
8 张训海;鸡马立克氏病监测技术的研究及应用[D];南京农业大学;2003年
9 付朝阳;J亚群禽白血病病毒分离株变异分析及重组抗原ELISA检测方法的建立[D];中国农业科学院;2004年
10 张志;我国近年来马立克氏病病毒野毒株分子流行病学和生物学特性的研究[D];山东农业大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李爽;鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D];华中农业大学;2010年
2 颜赟;鸡免疫抑制性病毒共感染的流行病学调查[D];山东农业大学;2010年
3 刘功振;禽白血病病毒J亚群、B亚群的分离鉴定及核酸探针的制备[D];山东农业大学;2010年
4 孙洪磊;整合禽网状内皮组织增生病病毒基因的鸡痘病毒分子生物学鉴定及致病机理研究[D];山东农业大学;2010年
5 王广伟;枣庄地区鸡大肠杆菌病的防治研究[D];山东农业大学;2010年
6 孟斌;山东省白羽肉鸡免疫抑制病病原学和血清学调查[D];山东农业大学;2010年
7 杨明;鸡传染性贫血病毒与其它免疫抑制性疾病共感染的相互作用[D];山东农业大学;2010年
8 朱美真;山东某地方品系鸡鸡胚中禽白血病病毒的分离及序列分析[D];山东农业大学;2010年
9 郭文龙;规模化肉鸡场主要免疫抑制性疫病的分子流行病学调查及传播特点分析[D];山东农业大学;2010年
10 李中明;某蛋种鸡群ALV流行病学及生物学特性的初步研究[D];山东农业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 崔治中;L.F.Lee;;用杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达马立克病病毒pp38基因[J];中国病毒学;1992年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 宋坤;王喜军;温志远;葛金英;冯娜;胡旭乐;陈伟业;高玉伟;夏咸柱;步志高;;表达扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建[J];中国预防兽医学报;2013年06期
2 秦克锋,汪美先,姜绍淳,马文煜;单纯疱疹病毒2型三万道尔顿糖蛋白的纯化及其特性研究(摘要)[J];细胞与分子免疫学杂志;1985年03期
3 王锡乐,张志,姜世金,崔治中;昆虫细胞表达的网状内皮组织增殖症病毒囊膜糖蛋白及其免疫性[J];微生物学报;2005年04期
4 胡文兵;关平原;李平安;郝瑞峰;;牛传染性鼻气管炎病毒部分糖蛋白的研究进展[J];畜牧与饲料科学;2008年04期
5 姜甜甜;张大丙;;鸭瘟强毒与疫苗毒的囊膜糖蛋白序列比较[J];中国兽医杂志;2013年02期
6 崔治中,吴艳涛;“八五”兽医生物技术研究进展[J];畜牧兽医科技信息;1997年15期
7 黄长形,杨为松,杭长寿,白雪帆,李光玉;用不同载体在大肠杆菌中表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1和G2[J];中国病毒学;1997年04期
8 刘文强;范伟兴;赵宏坤;;猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E基因的序列结构分析[J];中国动物检疫;2006年10期
9 张文娟;裴宗飞;牛钟相;;REV囊膜糖蛋白的表达、纯化及单克隆抗体的制备和初步鉴定[J];中国兽医学报;2010年02期
10 周斌;刘珂;魏建超;陈溥言;;整合猪瘟病毒囊膜糖蛋白假型鼠白血病病毒微量中和试验的建立和初步应用[J];畜牧兽医学报;2011年11期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
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2 邹庆;程安春;汪铭书;徐超;;DEV gC基因疫苗在免疫小鼠分布规律的研究[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(下册)[C];2010年
3 徐树兰;童铁钢;白宇;刘光亮;肖一红;王群;张维军;吴东来;;赤羽病病毒囊膜糖蛋白G1基因片段重组杆状病毒表达载体的构建及表达[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十五次、中国病理生理学会动物病生专业委员会第十四次学术讨论会论文集[C];2007年
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5 牛钟相;张文娟;;REV囊膜糖蛋白的表达、纯化及单克隆抗体的制备[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
6 韩凌霞;陈雷;丁家波;刘岳龙;秦爱建;;MDV囊膜糖蛋白Ⅰ原核表达产物单克隆抗体的制备[A];第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2001年
7 张富强;李志华;张念祖;;CSFV囊膜糖蛋白E2中和表位的定位研究[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
8 赵磊;王旋;龚争;孙涛;丁维民;张训海;;抗鸡NDV囊膜糖蛋白单抗的制备与抗原表位鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
9 王海震;李学仁;周斌;陈溥言;;猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因A/D区的构建及原核表达研究[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(下册)[C];2004年
10 李斌;卢冰霞;秦毅斌;赵武;梁家幸;韦超文;何颖;苏乾莲;陈忠伟;闭炳芬;段群棚;李莹莹;姜佳佳;梁保忠;黄伟坚;;猪乙型脑炎病毒广西分离株FC792的囊膜糖蛋白E基因克隆及生物信息学分析[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 秦爱建;禽白血病病毒J亚群囊膜糖蛋白基因的生物学和生物化学特性[D];扬州大学;1999年
中国硕士学位论文全文数据库 前9条
1 宋坤;表达扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建[D];中国农业科学院;2013年
2 张文韬;猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的克隆表达及间接ELISA方法的建立[D];西南大学;2012年
3 李晶;猪巨细胞病毒囊膜糖蛋白B重组抗原的研制及应用[D];湖南农业大学;2009年
4 倪楠;鸭群中REV感染的流行病学调查及囊膜糖蛋白基因的序列分析[D];山东农业大学;2008年
5 郑小坚;猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因融合表达载体的构建及初步表达[D];苏州大学;2003年
6 刘瑞峰;猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的表达研究及其单克隆抗体的制备[D];华中农业大学;2008年
7 刘珂;猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白B-cell线性化表位的表达及免疫活性研究[D];湖南农业大学;2008年
8 刘文强;伪狂犬病病毒La株的分离鉴定和囊膜糖蛋白E基因的克隆及序列分析[D];山东农业大学;2002年
9 张文娟;REV囊膜糖蛋白env基因的原核表达及单克隆抗体的制备与应用[D];山东农业大学;2009年
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