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《扬州大学》 2000年
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新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因和表达该基因的重组鸡痘病毒

吴艳涛  
【摘要】: 新城疫(ND)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一,而新城疫病毒 (NDV)F_(48)E_8株则是中国的标准嗜内脏速发型强毒。为了明确NDV F_(48)E_8株的致 病机理,同时也为了研制免疫保护率高、保护期长的ND基因工程疫苗,本研究对 与F_(48)E_8株致病性和免疫原性密切相关的融合蛋白(F)基因进行了克隆、序列分 析,构建了表达该基因的重组鸡瘟病毒(rFPV),并测定了rFPV的免疫效力。现从 四个方面概述如下: 一、以酚-SDS法提纯的NDV F_(48)E_8株基因组RNA为模板,采用反转录聚 合酶链反应(RT-PCR),分别扩增到长为926bP的糖蛋白基因片段和长为 1710bP的F基因。以Digoxigenin标记的糖蛋白基因核酸探针能特异性地检测 NDV基因组RNA,而与其它病毒RNA不发生反应。F基因RT-PCR产物则被 插入到质粒载体的多克隆位点,经酶切分析和Southern分子杂交筛选到阳性重 组质粒克隆pF37。 二、对NDV F_(48)E_8株F基因的序列进行全面分析。该基因编码由553个氨基 酸组成的F_0前体。在第116-117位氨基酸处,F_0被切割成F1和F2多肽;切割位 点的序列为RRQRR↓F,含两对碱性氨基酸,具有强毒株的特征。F_0中有3个主 要由疏水性氨基酸组成的区域,其中F_2多肽N端起信号肽作用,介导蛋白质跨膜 转位;F1多肽的N端是起融合作用的主要部位,亦称融合多肽;F1亚单位的C端 为跨膜区。F蛋白中有两个七肽重复序列(HR1和HR2),HR1紧邻融合多肽的C 端,HR2则靠近跨膜区的N端,它们能形成α螺旋结构和相互作用的疏水性界面。 在F_0氨基酸序列中,发现6个可糖基化位点和12个半胱氨酸残基。F_(48)E_8株和 Miyadera株、Texas GB株F_0的氨基酸同源性分别为93.64%和92.41%。根据F 蛋白的酶切位点分布,F_(48)E_8株被归于基因Ⅲ型;在遗传发生上和AUS Victoria 株、Miyadera株距离较近,是第一次ND世界范围内大流行的代表毒株。F_(48)E_8株 和近年来国内流行的野外分离株之间,F蛋白表现出较高的同源性,主要功能区 保守,因此F基因可以作为基因工程疫苗的目的基因。 三、经一系列步骤将NDV F_(48)E_8株F基因定向导入鸡痘病毒FPV插入载体 pFG1175—1中痘苗病毒启动子P7.5的下游,得到转移载体pFGF1175—1。以转 移载体和脂质体共转染FPV中国疫苗株282E4感染的鸡胚成纤维细胞,经多次 蓝斑筛选和克隆纯化,得到稳定生长的重组鸡痘病毒rFPV-NDF。间接免疫荧光 试验证实,rFPV-NDF感染的鸡胚成纤维细胞中表达了NDV的F基因。 四、评价了表达 NDV F。sEs株 FhN和 NP基因的 rFPV—NDF、rFPV一 NDHN和rFPV—NDNP的免疫效力。在用SPF鸡进行的免疫效力试验中,28日 龄的试验鸡接种rFPV—NDF和rFPV—NDHN后,能产生对大剂量NDV强毒 攻击的抵抗,保护率分别达 96.7%和 93.3%。将 rFPV—NDF和 rFPV—NDHN 结合使用并没有进一步提高保护率。从接种 rFPV—NDF和 rFPV—NDHN的试 验鸡血清样品中检测出中和抗体,效价达1:27。和Lasota疫苗一样,NDV强毒仍 能在rFPV免疫鸡体内复制。本试验还证实,rFPV—NDNP不能使接种鸡产生中 和抗体和对强毒攻击的保护作用。 在用含NDV母源抗体的商品肉鸡进行的免疫效力试验中,rFPV免疫鸡同样 显示了对NDV强毒攻击的抵抗力*日龄雏鸡接种疫苗后/FpV—NDFJFpV一 NDHN、rFPV—NDF/rFPV—NDHN和Lasota分别产生80.0%、60.0%、64.0% 和 72.0%的保护率,以 rFPV—NDF产生的保护率最高。rFPV免疫鸡的NDV HI 抗体消长规律和未注射疫苗的健康对照组相似,rFPV—NDHN免疫鸡也没有产 生高效价HI抗体,说明rFPV的免疫效力一部分是由于记忆性B细胞和细胞免 疫提供。 在用含NDV母源抗体的商品肉鸡进行的rFPV—NDF二次免疫效力试验 中,两次均以 rFPV—NDF免疫的鸡群和先后以 rFPV—NDF和 Lasota免疫的鸡 群能产生完全的保护率;而先接种Lasota,后接种rFPV—NDF及Lasota的鸡群 产生的保护率为95%。rFPV—NDF受NDV抗体的干扰较小,一次接种可产生 足够的免疫记忆,再次接种能激发强烈的免疫反应,展示了其作为侯选疫苗毒株 的可能性。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前5条
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【参考文献】
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【共引文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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7 胡静涛;杨文涛;肖冲;王泽;丁壮;王春凤;;GFP标记的重组新城疫病毒HN基因乳酸菌表达载体的构建[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
8 鲁会军;金扩世;韩松;金宁一;;猪源新城疫病毒JL01株分离鉴定及F基因遗传进化分析[A];中国畜牧兽医学会食品卫生学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2010年
9 张蕊;蒲娟;苏敬良;赵继勋;王晓婷;张守平;李晓娇;张国中;;新城疫病毒国内分离株的序列测定与分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
10 王志玉;于修平;;糖化作用对新城疫病毒HN糖蛋白功能的影响[A];山东免疫学会、山东微生物学会医学微生物学专业委员会、山东省医学会微生物学和免疫学专业委员会、山东省医药生物技术学会2001年学术年会论文汇编[C];2001年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 惠岭;鹧鸪新城疫咋防治[N];河北农民报;2006年
2 吕纪增;鹧鸪新城疫的防治[N];中国畜牧兽医报;2006年
3 张艺兵 黄丛平;山东局推广RT-PCR检测方法[N];中国国门时报;2004年
4 河北省辛集市畜禽科技服务中心 肖亚彬 任灵霞 梁剑峰;蛋鸡传喉和新城疫混合感染[N];江苏农业科技报;2006年
5 郑安明;美国研制成功新一代新城疫疫苗[N];中国国门时报;2006年
6 中国科学技术信息研究所;墨西哥育出新城疫疫苗玉米[N];农资导报;2006年
7 清苑职教中心 张俊杰;当前流行鸡病好难治[N];河北农民报;2006年
8 记者 彭溢;哈兽研抗击禽流感再出“杀手锏”[N];黑龙江日报;2008年
9 山东省农科院 张秀美;近期鸡新城疫流行特点与原因分析[N];中国畜牧兽医报;2006年
10 邢台市兽医院 邢兰君;治蛋鸡新城疫和肾传支混合感染中西医结合疗效好[N];河北农民报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 党源;新城疫病毒单感染及猪流感病毒与猪链球菌共感染差异蛋白组学分析[D];吉林大学;2013年
2 胡海霞;表达C亚型禽偏肺病毒糖蛋白和融合蛋白的重组新城疫病毒二价苗的构建及免疫效力评价[D];吉林大学;2011年
3 刘培欣;新城疫病毒单克隆抗体制备及部分NP蛋白抗原表位鉴定分析[D];东北农业大学;2011年
4 陈胜利;不同宿主来源新城疫病毒全基因组特征及其V蛋白对DF-1细胞IFN-β生成的影响[D];西北农林科技大学;2013年
5 丁壮;新城疫病毒HN蛋白基因的克隆、序列分析、表达及其免疫原性研究[D];中国人民解放军军需大学;2001年
6 胡增垒;基因Ⅶd亚型新城疫病毒严重侵害免疫系统的分子基础和宿主机制[D];扬州大学;2013年
7 耿捷;基因芯片检测新城疫病毒和PCR结合内切酶分析鉴别新城疫强弱毒株的研究[D];西北农林科技大学;2004年
8 赵伟;新城疫病毒VG/GA毒株反向遗传系统的建立及最佳外源基因表达位置的确定[D];西北农林科技大学;2013年
9 邵朝纲;水稻齿叶矮缩病毒的分子生物学研究及新城疫病毒检测新技术[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
10 蔡丽娅;临床新城疫病毒分离鉴定及F蛋白单克隆抗体的研制与应用[D];扬州大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 曲鲁江;新城疫病毒单克隆抗体的建立及其遗传变异分析研究[D];新疆农业大学;2001年
2 巩艳艳;抗体免疫选择压作用下新城疫病毒HN基因和F基因的变异[D];山东农业大学;2010年
3 孙委委;两株新城疫病毒分离株全基因组序列的测定及在CEF和鸡胚传代的含量变化分析[D];中国农业科学院;2010年
4 胡北侠;新城疫病毒融合蛋白单克隆抗体的研制[D];扬州大学;2001年
5 梅双双;新城疫病毒野毒株的分离鉴定及其融合蛋白部分序列同源性分析[D];河北农业大学;2002年
6 王海燕;新城疫病毒F_48E_9株接种鸡胚的病理学观察及其P蛋白基因的克隆与表达[D];内蒙古农业大学;2001年
7 米志强;新城疫病毒昌黎株F基因的序列分析、表达及重组病毒免疫原性的研究[D];中国人民解放军军需大学;2001年
8 葛涛;新城疫病毒HN基因抑瘤效应机制的研究[D];中国人民解放军军需大学;2002年
9 邓明俊;新城疫病毒F基因真核表达质粒的构建及动物免疫试验[D];西北农林科技大学;2003年
10 于淼;高分子微球检测新城疫病毒的研究[D];吉林农业大学;2006年
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