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新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因和表达该基因的重组鸡痘病毒

吴艳涛  
【摘要】: 新城疫(ND)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一,而新城疫病毒 (NDV)F_(48)E_8株则是中国的标准嗜内脏速发型强毒。为了明确NDV F_(48)E_8株的致 病机理,同时也为了研制免疫保护率高、保护期长的ND基因工程疫苗,本研究对 与F_(48)E_8株致病性和免疫原性密切相关的融合蛋白(F)基因进行了克隆、序列分 析,构建了表达该基因的重组鸡瘟病毒(rFPV),并测定了rFPV的免疫效力。现从 四个方面概述如下: 一、以酚-SDS法提纯的NDV F_(48)E_8株基因组RNA为模板,采用反转录聚 合酶链反应(RT-PCR),分别扩增到长为926bP的糖蛋白基因片段和长为 1710bP的F基因。以Digoxigenin标记的糖蛋白基因核酸探针能特异性地检测 NDV基因组RNA,而与其它病毒RNA不发生反应。F基因RT-PCR产物则被 插入到质粒载体的多克隆位点,经酶切分析和Southern分子杂交筛选到阳性重 组质粒克隆pF37。 二、对NDV F_(48)E_8株F基因的序列进行全面分析。该基因编码由553个氨基 酸组成的F_0前体。在第116-117位氨基酸处,F_0被切割成F1和F2多肽;切割位 点的序列为RRQRR↓F,含两对碱性氨基酸,具有强毒株的特征。F_0中有3个主 要由疏水性氨基酸组成的区域,其中F_2多肽N端起信号肽作用,介导蛋白质跨膜 转位;F1多肽的N端是起融合作用的主要部位,亦称融合多肽;F1亚单位的C端 为跨膜区。F蛋白中有两个七肽重复序列(HR1和HR2),HR1紧邻融合多肽的C 端,HR2则靠近跨膜区的N端,它们能形成α螺旋结构和相互作用的疏水性界面。 在F_0氨基酸序列中,发现6个可糖基化位点和12个半胱氨酸残基。F_(48)E_8株和 Miyadera株、Texas GB株F_0的氨基酸同源性分别为93.64%和92.41%。根据F 蛋白的酶切位点分布,F_(48)E_8株被归于基因Ⅲ型;在遗传发生上和AUS Victoria 株、Miyadera株距离较近,是第一次ND世界范围内大流行的代表毒株。F_(48)E_8株 和近年来国内流行的野外分离株之间,F蛋白表现出较高的同源性,主要功能区 保守,因此F基因可以作为基因工程疫苗的目的基因。 三、经一系列步骤将NDV F_(48)E_8株F基因定向导入鸡痘病毒FPV插入载体 pFG1175—1中痘苗病毒启动子P7.5的下游,得到转移载体pFGF1175—1。以转 移载体和脂质体共转染FPV中国疫苗株282E4感染的鸡胚成纤维细胞,经多次 蓝斑筛选和克隆纯化,得到稳定生长的重组鸡痘病毒rFPV-NDF。间接免疫荧光 试验证实,rFPV-NDF感染的鸡胚成纤维细胞中表达了NDV的F基因。 四、评价了表达 NDV F。sEs株 FhN和 NP基因的 rFPV—NDF、rFPV一 NDHN和rFPV—NDNP的免疫效力。在用SPF鸡进行的免疫效力试验中,28日 龄的试验鸡接种rFPV—NDF和rFPV—NDHN后,能产生对大剂量NDV强毒 攻击的抵抗,保护率分别达 96.7%和 93.3%。将 rFPV—NDF和 rFPV—NDHN 结合使用并没有进一步提高保护率。从接种 rFPV—NDF和 rFPV—NDHN的试 验鸡血清样品中检测出中和抗体,效价达1:27。和Lasota疫苗一样,NDV强毒仍 能在rFPV免疫鸡体内复制。本试验还证实,rFPV—NDNP不能使接种鸡产生中 和抗体和对强毒攻击的保护作用。 在用含NDV母源抗体的商品肉鸡进行的免疫效力试验中,rFPV免疫鸡同样 显示了对NDV强毒攻击的抵抗力*日龄雏鸡接种疫苗后/FpV—NDFJFpV一 NDHN、rFPV—NDF/rFPV—NDHN和Lasota分别产生80.0%、60.0%、64.0% 和 72.0%的保护率,以 rFPV—NDF产生的保护率最高。rFPV免疫鸡的NDV HI 抗体消长规律和未注射疫苗的健康对照组相似,rFPV—NDHN免疫鸡也没有产 生高效价HI抗体,说明rFPV的免疫效力一部分是由于记忆性B细胞和细胞免 疫提供。 在用含NDV母源抗体的商品肉鸡进行的rFPV—NDF二次免疫效力试验 中,两次均以 rFPV—NDF免疫的鸡群和先后以 rFPV—NDF和 Lasota免疫的鸡 群能产生完全的保护率;而先接种Lasota,后接种rFPV—NDF及Lasota的鸡群 产生的保护率为95%。rFPV—NDF受NDV抗体的干扰较小,一次接种可产生 足够的免疫记忆,再次接种能激发强烈的免疫反应,展示了其作为侯选疫苗毒株 的可能性。


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