收藏本站
《扬州大学》 2001年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

鸡贫血病毒中国株基因序列比较、病毒编码蛋白的表达及分子克隆化病毒的构建

刘岳龙  
【摘要】: 鸡贫血病毒(Chicken anaemia virus,CAV)是引起雏鸡再生障碍 性贫血、淋巴组织萎缩和成年鸡免疫抑制的鸡贫血病的病原。尽管各 地分离毒株之间的序列同源性很高,但也有差异。本文对中国分离株 的基因组DNA进行了PCR扩增和序列测定比较。首先对中国5株不 同来源的CAV疑似病料(YZ9903、HA9805、JN0007、JL0010、KM9801 株)用CAV全基因组核酸探针进行了斑点杂交,验证为阳性后,将病 料组织DNA和病料感染细胞(MSB1细胞)DNA进行CAV基因组细胞凋 亡素基因片段(0.35kb)的PCR扩增和序列测定,结果发现5个中国 毒株的VP3基因序列完全相同,也与美国CIA-1株序列完全一致;与 德国CUX-1株相比有一个核苷酸的差异(第674位C→T),但和其它 参考毒株的这一位置的核苷酸一致,都为T;与日本TR20株、澳大利 亚CAU269-7株序列的同源性也很高。所有毒株VP3序列有一个明显 的特点,即核苷酸的差异仅出现于VP3编码基因(366个核苷酸)的 前158个核苷酸区域,后208个核苷酸则没有变化。目前已知的CAV VP3 的编码氨基酸(121个)有共同的氨基酸序列特征,即含有2个脯氨 酸(Pro)丰富区域和2个强碱性氨基酸—精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys) 的密集区域。上述CAV毒株之间VP3基因区域核苷酸变异所导致的氨 基酸变异都没有引起这些重要结构区域的变化,这也再次证明了VP3 与功能密切相关的二类氨基酸区域的保守性。 在体外扩增中国分离株HA9805株和JN0007株的全基因组时,将 完整的基因组序列分为1.0kb、0.6kb、和0.8kb三段分别扩增出来, 并成功地对CAV基因组1.5kb(1.0kb、0.6kb二段)测定了核酸序列。 HA9805株和JN0007株1.5kb序列和已知的参考毒株(CUX-1株、CIA-1 株、TR20株、CAU269-7株)相应序列相比,同源性很高(95%以上)。 HA9805毒株和CUX-1毒株序列同源性最高(98.6%),JN0007毒株与 TR20毒株序列同源性最高(98.5%),CAU269-7毒株与其它所有的毒 株的同源性都相对较低。在已测定的基因序列中,编码区核苷酸变异 很少,尤其是VP2编码区域的后半部分极为保守。核苷酸变异在其余 的区域则是随机分布。基因编码区内的大多数的核苷酸变化并没有导 致氨基酸的改变,即为无义突变,只有少量的核苷酸的变异导致了相 应氨基酸的改变,这些氨基酸的改变对CAV的编码蛋白高级结构的影 响有多大还不清楚。但Randall等(1996)发现的VP1高变区(第139-1 位氨基酸)在HA9805株和JN0007株VP1编码区也出现了。在二株 中国株CAV基因组的非编码区也同样出现其它CAV共同的病毒核酸复 制和基因转译所需的重要调控元件。 在前期研究中,本实验室己获得CAV病毒全基因组的体外克隆、 但在病毒非编码区(也是病毒复制和转译调控区)存在不完整的EC叩 1 识别序列(5’-GACTTC-3’)、因而是不能自身环化的重组子 (pCAVZ.4,5.okb人 在此基础上,本研究通过 PCR定向点突变法, 将 pCAVZ.4的病毒非编码区的不完整的 EcoR序列(5’-GACTTC-3’) 突变为完整的 ECOR识别序列(5’-GAATTC-3’),从而有利于 CAV基 因组的体外环化。将此重组子命名为 pCAVE”(5.okb人 将 pCAVE“大量 扩增,用 E。觎 l切出 CAV基因组 2.3kb片段,在体外自身连接。用绿 色荧光素报告基因(PEGFP)预转染 MS盯细胞,确定转染 DNA最佳的 用量条件为 1.0 u g、最佳的转染细胞密度为 lx10‘个/ml。将上述 2.3kb 的自身连接产物在转染剂Effectene的作用下转染CAV的宿主细胞系 (MSBIL 经过 7-8 代的连续传代,获得了明显的具复制活性的 CAV 病毒。将此病毒经肌肉途径感染1日龄SPF易感雏鸡,在14* 天能 出现典型的病变。将 pCAVE”中的病毒基因组(2.3kb)插入 pCAVZ.4 的单一E。叩I位点,构建了含有双拷贝CAV全基因组同方向串联的重 组子(命名为PCAVZE”,7.3kb人 将此PCAVZE”环型质粒大量扩增并直 接转染MSBI 细胞,同样获得了可复制性的病毒。本研究在病毒的非 编码区特定位点进行点突变,构建了含有单拷贝CAV全基因组和双拷 贝全基因组同向串联的重组子,并在MSBI 细胞成功转染为具复制活 性的完整病毒。本研究思路和实验方法为将来在基因组水平体外构建 低或无致病性的CAV活病毒的研究打下了基础。 本研究将 CAV基因组的三个编码蛋白衣壳蛋白(VPI* VPZ、细 胞凋亡素(或称 VP3)的编码基因,按正确的插入方向、译读框架分 别插入在原核表达性载体 PGEX-SX-3 中谷脱甘肽转移酶(GST)编码 基因之后,经过酶切分析、序列测定证实了所构建的重组子的正确性。 完整的VPI基因、及VPI大片段(缺失VPI的N-端21个氨基酸和C- 端4个氨基酸的VPI)插入后未获得明显表达。将VPI大片段再分为 VPI片段 1(672hP)和片段2(608hPL 分别插入载体后获得了表达。 完整的仟 和细胞凋亡素基因插入载体后也成功地获得了表达。将所 表达的融合蛋白经过SDS-PAGE电泳后分别回收,直接多次免疫小鼠, 制备了相应的鼠源抗血清,与CAV感染的MSBI 细胞作间接免
【学位授予单位】:

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王春晖;王剑松;王文举;詹辉;李鸿钧;颜汝平;徐鸿毅;;凋亡素蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价[J];中国生物工程杂志;2011年07期
2 ;[J];;年期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
11 ;[J];;年期
12 ;[J];;年期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 翟新验;卢胜明;;鸡贫血病毒[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
2 刘岳龙;崔治中;秦爱建;金文杰;;分子克隆化鸡贫血病毒的重建研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
3 庄金秋;梅建国;沈志强;;鸡贫血病毒实验室诊断方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
4 芦银华;谈国蕾;陈德胜;陈溥言;;猪圆环病毒Ⅱ型分子克隆化病毒的构建[A];猪的重要传染病防治研究新成果——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防检疫专业委员会第7次学术交流会论文集[C];2002年
5 刘岳龙;金文杰;吉荣;叶建强;秦爱建;崔治中;段玉友;;用鼠抗鸡贫血病毒VP1的多抗血清检测病毒感染的间接免疫荧光法的建立和应用[A];第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2001年
6 刘岳龙;崔治中;秦爱建;金文杰;孙春根;;鸡贫血病毒全基因组点突变体的体外构建及其在宿主细胞MSB1的转染研究[A];第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2001年
7 王晓艳;文刚;高玉龙;高宏雷;王笑梅;;鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备[A];提高全民科学素质、建设创新型国家——2006中国科协年会论文集[C];2006年
8 崔红玉;王云峰;石星明;童光志;;以BAC为基础的疱疹病毒反向遗传技术研究进展[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
9 连海;金宁一;米志强;李霄;解丽华;徐敬龙;金洪涛;李萍;;Apoptin与hIL-18基因对人结肠癌细胞的作用研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
10 杭柏林;秦爱建;钱琨;金文杰;沈海玉;吴晓平;仇钰;;J亚群禽白血病病毒TD-PCR检测方法的建立、优化与初步应用[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘岳龙;鸡贫血病毒中国株基因序列比较、病毒编码蛋白的表达及分子克隆化病毒的构建[D];扬州大学;2001年
2 王晓艳;鸡贫血病毒结构蛋白抗原表位研究及感染性克隆构建[D];中国农业科学院;2007年
3 连海;新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因抗肿瘤作用及其信号传导机制[D];吉林大学;2006年
4 韩苏夏;SP-TAT-VP3融合基因表达对肝癌治疗作用的实验研究[D];西北大学;2008年
5 寇冰;VP3/Apoptin融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡及对人肝癌裸鼠移植瘤生长抑制的研究[D];华中科技大学;2006年
6 管国芳;联合应用NDV HN基因、CAV VP3基因及IL-18基因对喉癌细胞的杀伤作用及其体内抑瘤效应研究[D];吉林大学;2006年
7 朱继红;NDV HN基因和CAV Apoptin基因对宫颈癌细胞的体外杀伤作用及其体内抑瘤效应研究[D];吉林大学;2008年
8 张兴晓;鸭圆环病毒的分子流行病学调查及诊断方法的建立[D];山东农业大学;2009年
9 郝军元;凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的研究[D];吉林大学;2006年
10 陈健;腺病毒介导的凋亡素对胆管癌作用的研究[D];第三军医大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张刚;鸡贫血病毒(CAV)vp1基因克隆与表达的研究[D];山东师范大学;2001年
2 张恒;鸡贫血病毒DNA疫苗的研究[D];山东师范大学;2003年
3 吴中勤;三株不同类型的鸡贫血病毒增殖特性的比较和VP3基因的克隆及序列分析[D];南京农业大学;2000年
4 任桂萍;鸡传统性贫血病毒(CAV)全基因克隆[D];东北农业大学;2000年
5 刘宝山;CAV VP1、VP2融合基因在大肠杆菌中的克隆及表达[D];中国农业大学;2004年
6 李刚;鸡传染性贫血的流行病学、病毒分离及其VP2基因表达的研究[D];中国农业科学院;2002年
7 袁顺辉;VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌细胞凋亡的实验研究[D];昆明医学院;2008年
8 王春晖;VP3与改良型TAT-VP3基因的真核表达及诱导人膀胱癌细胞凋亡的实验研究[D];昆明医学院;2007年
9 林欢;鸡贫血病毒VP1、VP2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及产物免疫保护性研究[D];中国农业科学院;2008年
10 吴艳红;鸡贫血病毒VP1基因的克隆、原核表达纯化以及多克隆抗体的制备[D];山东师范大学;2007年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978