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表达和共表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒

程坚  
【摘要】: H9亚型禽流感病毒(AIV)近年在我国部分地区广泛流行,给养禽业造成了严 重的经济损失。油乳剂全病毒灭活苗虽对该亚型禽流感的控制发挥了重要作用,但 由于其存在干扰免疫监测及成本较高等缺点,使用受到了限制。为了研制新型禽流 感疫苗以克服上述缺点,我们对H9亚型AIV中国分离株的血凝素(HA)基因和 鸡Ⅱ型干扰素基因(IFN-Ⅱ)进行了克隆、测序和分析,构建了表达HA基因及共 表达HA基因和鸡IFN-Ⅱ基因的两种重组鸡痘病毒(rFPV-HA、rFPV-HA-IFN-Ⅱ), 并测定了它们的免疫效力。 1 H9亚型AIV中国分离株HA基因cDNA的克隆及序列初步分析 以酚-SDS法提取H9N2亚型AIV中国分离株A/Chicken/China/F/1998(简称F 株)的基因组RNA,以此为模板,采用cDNA合成法及反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR),扩增到长度分别为1.1Kb和0.8Kb的两段HA基因片段。测序结果表 明,这两个片段覆盖了HA基因的完整阅读框架,且在它们的重叠区有单一的PstⅠ 酶切位点。利用这一酶切位点,将这两个片段连接成插入在质粒pUC18的HindⅢ 和SalⅠ位点之间的全长HA基因,得重组质粒pUCHA。测定pUCHA位于HindⅢ 和SalⅠ位点之间外源片段的核苷酸序列。 本研究获得的HA基因片段共有1708个核苷酸,包含了HA完整的阅读区的 1680个核苷酸,推测其编码560个氨基酸,其中前18个氨基酸为信号肽序列,其 余542个氨基酸组成的前体蛋白在第320位氨基酸处被切割为HA1和HA2多肽。 F株HA裂解位点的氨基酸序列为RSSR↓GLF,不含连续的碱性氨基酸,具有低 致病性AIV HA裂解位点的特征。F株与H9亚型AIV原型毒株 A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)的HA基因的同源性较低,氨基酸和核苷酸的同源 性分别为84.1%和82.9%。 n 扬州大学博士学位论文 以 HAI CDNA的 55-1004 n酸为基元,建立 1992-1999年间 HgNZ亚型 AIV 中国及绷边国家和地区分离株的遗传发生树。结果表明,近年来在这一地区流行 的HgNZ亚型AJV招可敞为三憎系,同一谱系内,毒株间HA艄酸的同源 性在95%以上。F株与髓地区的部分俯株及94年北京分离株的亲龈系较近, 形成谱系卜 香港地区的另一些分离株和巴基斯坦分离株形成谱系2,它们与某些 南美分离株的亲缘关系很近;与谱系1的亲缘关系也较近,它们之间HA核昔酸的 同源性在 gi%R右;韩国分离株形成的谱系 3,该谱系与谱系 1、二的亲缘关系很 远,它们之间HA核昔酸的同源性只有83%左右。 2 表达HA辜因的直组鸡痘病霉的构巨 以 Hnd皿及 Sal消化PUCHA,得到 1.7Kb的 HA基因片段,将n向插人 FPV插入载体 11 75的 Hnd Ill和 Sal位点之间,使之处于痘苗病商启动子 P7.5的 下游,得到转移删 11 75HA。按常规的B眠脓染方法将其转染至已感染 FPV中 国疫酣282E4(Wt郴)的鸡胚成纤测胞(CEF),通过筛选蓝色的病毒腑 获得并纯化重组鸡痘病毒uV-HA。以PCR $$1;ill实,dq,v-HA基因组中插有 HA基因:以间接兔疫荧光肌实,fPV-HA感染的C扭釉了HA。 3 表达鸡IFN-H羹因的匣组鸡痘病羹的钩 来达产物的生物活性 根据已发表的鸡 WN0基因序列,设计一对5!物,以 RTPCR方法从经 Con A 刺激的鸡脾脏细胞中扩增出全长的鸡IFN二基因的cDNA序列。将扩增的基因片 段定向插人质粒 AF09的 Sal和 Hnd IH位点之间,使其位于痘苗病毒早晚期启动 子PEI的下游。 根据启动子 P肌的序列设计上游引物,鸡 IFNl基因的 cDNA 3 M列设计. 下游5!物,以PCR法扩增包含痘苗病毒早晚期启动子PM在内的鸡IFN刁的基因 片段。经一系列步骤,将扩增片段定向插人 FPV JWA载体 11 75中,得到转移载体 1175IFN,用以转染已感染tFPV的CEF,并按上述重组病毒的构建和纯化方法, 获得插谰 rw-n基因的靴重赈毒 ev-r:w-11。在 rrnv-lrx-11中,rw-11 基因处于PDe的转录调控下。 以细胞病鲫制W侧-IFNI感染的CEF越了具有抗水泡性口炎病 毒(VSV)活性的鸡IFN刁。fPV-mI(M.O.H.m)感染CEF 72小时后,培 养上清中 IFN刁的表达量为 1280 U/ITl。动物硼表明,接种 rFPV-IFN刁 天或 14天后,其表达的 IFNJ可显著减轻载体鸡痘病毒对 1日龄 SPF tills{$重增长的 程坚:表达和共表达Hg亚型肖流感病毒HA基因和鸡!FN坝基因的重组鸡痘病毒 * 抑制作用。 4A表达HA墓因和鸡HN-11基因的直组鸡扈清羹的构建 经一系列步骤,将IFN-11的基因及其上游的启动子PM插人含全长HAcDNA 的质粒pUCm中,得重组质粒PHAIFN。在PHAJFN中,HA基因和IFN刁基因 的3’糊邻。将串联在一起的HA基因和IFNJ基因(包含上游启动子Py)片 段切下,将其定向插人 FPV e载体 11 75中,得到转移狲 11 75HAIFN。在 11 75HAff:N中,HA基因和 IFN。11基因分别处于启动子 P7.5和 PWh的转录控制下, 且转录方向正好相对。在IFN-11基因3’端有一痘苗病毒转录终止子,可避免这两 个基


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