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《扬州大学》 2001年
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马立克氏病病毒gB、gI、pp38基因的原核系统表达及其特异性单抗的研制和初步应用

韩凌霞  
【摘要】: 为了用免疫转印反应(Western-blot)作为指示系统来比较不同致病型马立克氏 病病毒(MDV)主要蛋白质的“带型”(protein band pattern),本研究利用原核表 达载体pGEX-6p-1质粒,构建了能分别表达gB、gI和pp38的重组载体质粒,以 在大肠杆菌中表达的主要呈一级结构的重组gB、gI和pp38分别免疫小鼠,通过 间接免疫荧光抗体试验(IFA),针对感染了MDV的鸡胚成纤维细胞(CEF)作为 筛选用抗原,以期获得能在免疫转印反应中识别变性蛋白质中与一级结构相关的 抗原表位的杂交瘤细胞。结果得到MDV的gB、gI和pp38的一组特异单克隆抗体。 用重组gB的N-片段GST融合蛋白免疫小鼠后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞 融合反应,以能表达重组gB蛋白的细菌裂解物为检测抗原包被酶标板,筛选到6 株ELISA阳性杂交瘤细胞,经亚克隆化获得了稳定分泌特异抗体的杂交瘤细胞株。 将杂交瘤细胞培养上清与GA株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行IFA反应,得 到1株MDV特异性的单抗7C8。7C8单抗腹水与GA-CEF的IFA效价达1∶2000, 免疫转印试验结果表明,7C8能对所有检测过的血清Ⅰ型MDV株感染CEF裂解液 中清晰而稳定地识别出分子量大约为100kD、60kD、49kD的MDV囊膜糖蛋白B 抗原。虽然国内外已有多株抗MDVgB单抗的报道,但这是第一株能在免疫转印 反应中从Ⅰ型MDV感染细胞中稳定地检测出所有gB复合物的3条蛋白带的单克 隆抗体。 用重组gI GST融合蛋白免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,以648A 感染的CEF为筛选抗原,通过IFA获得了9株gI特异性的杂交瘤细胞:分别命名 为2H_3、3H_5、4B_8、6E_2、2E_6、6F_(10)、4H_2、2H_7、1B_(11)。其中3株杂交瘤细胞2H_3、 6F_(10)、2H_7在单克隆化后腹腔注射BalB/C 小鼠,获得的腹水抗体稀释度在1∶100 至1∶200之间均可与不同毒株MDV感染的CEF具有IFA反应性,与其裂解液在 dot-ELISA中呈特异性显色,在免疫转印反应中,可从RB1B株、CVI988株感染 2 扬州大学博士论文 CEF的裂解液中识别出大约32kD的@蛋白带,这是国内外首次报道的MDVgl 特异性的单克隆抗体。 用1型MDV疫苗株CVI988株来源的大肠杆菌表达的重组pp38免疫小鼠的脾 细胞与骨髓瘤细胞进行融合,间接免疫荧光试验检测,筛选到8株抗pp38的单克 隆抗体,分别命名为Zllll7、6GHS、gGA4、IGg、4ADZ、SGDS、gF10、6HCS。 用其制备腹水单抗,在卜500稀释下可与所有1型MDV感染的CEF显示强IFA 反应,其中gGA4、SGDS在兔疫转印反应中能从MDV感染CEF的裂解液识别出 约35kD的特异性蛋白带。这些单克隆抗体填补了我国对pp38单抗的空白。特别 引人注意的是,抗pp38单抗IGg、4ADZ、gGA4、SGDS不仅与所有测试过的1 型MDV反应,还能与* 型HVT反应。这一结果表明,Ill型HVT与互型MDV 间存在能被单抗识别的共同的抗原表位。这一结果进一步直接证实了我们过去用 在昆虫细胞中表达的重组pp38做交叉免疫反应所作出的“在*和*型MDV中 存在着与I型MDVpp38有一定同源性的蛋白多肽”的推论,并进而可进一步识别 出这一个(或几个)共同表位的在pp38及其类似物上的位置及氨基酸序列。这是 国际上第一组能显示1型和Ill型MDVpp38共同表位的单克隆抗体。 本研究研制的针对 gB、gi和 pp38的多株单克隆抗体的组合,有可能进一步用 于探索不同致病型MDV在细胞中表达的不同蛋白质“带型”的研究,即比较不同 毒株在细胞和组织中相关蛋白质表达量的比例关系上的差异,及不同蛋白质由于 表达后再加工程度不同而造成的电泳迁移率的差异。针对gB上与变性蛋白一级结 构相关抗原表位的单克隆抗体7C8亦可用于表达gB的基因工程疫苗病毒的表达特 性的研究,对掣的单抗也可用作筛选重组9-禽痘病毒的重要试剂。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S852.65

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