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《扬州大学》 2002年
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马立克氏病病毒meq基因功能的研究

韦平  
【摘要】: 马立克氏病病毒(Marek's Disease Virus,MDV)之众多已得到鉴定的基因中,目前有3个基因即132-bpr、pp38、meq可能与致瘤相关。其中,meq与132-bpr两个基因是MDV-1所特有,已证实132-bpr的拷贝数与毒株的体外致弱程度有关,pp38则被证实可抑制机体的免疫应答。meq基因由于具有与致瘤基因jun/fos家族类似的分子结构,因此,我们有理由认为meq基因在MDV致病、致瘤中可能发挥重要的作用。 本研究通过三个方面进行了研究,取得了如下主要实验结果: 1 MDV不同致病型(pathotypes)毒株meq基因序列的比较研究 应用PCR技术扩增了不同致病型MDVs,即国际通用Ⅰ型疫苗毒CV1988/Rispens株和中国特有的疫苗毒814株、特超强毒648A株(vv+MDV)以及6个广西分离到的野毒株共9个毒株的meq基因,进行核苷酸序列的测定并与标准强毒GA株(vMDV)进行核苷酸和氨基酸序列的比较。结果发现,MDV不同致病型的meq基因序列相对比较保守,它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高;但是,与所有七个致瘤性的MDV毒株相比,二个Ⅰ型弱毒疫苗CV1988/Rispens株和814株均出现了两个特征性的突变:即第194位的P缺失性突变和第71位氨基酸由A变成了S的位点突变;缺失性突变恰恰位于meq基因中转录激活域内的一个多脯氨酸的重复序列(PPPP)之中。此外,研究还发现了meq基因的两类有趣的重复结构,其中一类是含15个氨基酸残基(EELCAQLCSTPPPPI)的结构,有2个重复,另一类是含6个氨基酸残基(PPICTP)的结构,共有4个重复,它们全部分布在MEQ蛋白C-端的转录激活域内。 2 meq基因产物的鉴定及其细胞内表达特征的研究 源于MDV GA株的meq基因被克隆到杆状病毒转移载体质粒pBluBac4中强有力的多角体蛋白启动子(P_(PH))之后,经与线性化的Bac-N-Blue DNA共转 扬州大学博士学位论文三 染于昆虫细胞系SFg,获得了重组杆状病毒。应用重组痘病毒表达的MEQ制 备的单抗23B46对重组杆状病毒感染的SFg细胞及其裂解物分别进行间接免疫 荧光试验、Westem Blot和免疫沉淀试验的检测。结果发现:本表达系统产生 的MEQ蛋白可被重组痘病毒表达的MEQ制备的单抗23B46所识别;在感染 细胞中,MEQ蛋白仅局限于细胞核内,而且随着感染后(PI)时间的增加,具有 从核质向核仁和核膜转移的趋向;W已stem Blot和免疫沉淀试验均证实重组杆 状病毒感染细胞裂解物中出现有两条大小约为60 kD的特异带。实验的结果证 明杆状病毒/昆虫细胞系统用于表达外源基因可行有效。 利用通过杆状病毒载体在昆虫细胞系SFg上高度表达的MEQ蛋白产物免 疫BALB/c小鼠,然后收获其免疫脾细胞并与肿瘤细胞系SPZ/0通过PEG于体 外融合;获得的杂交瘤细胞被克隆并通过与MDV感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)做免疫荧光试验(FA),进行其分泌抗MEQ单克隆抗体(McAb)能 力的筛选。获得4株稳定产生抗MEQ蛋白McAb的杂交瘤细胞,其中3G12E6 单抗通过FA和免疫酶组化技术能够检测到MDV致瘤株感染的CEF及自然 MD肿瘤细胞中表达的me叮基因产物,而在非致瘤株CVI988/Rispens感染的 CEF和免疫的正常鸡的组织中则未检测到。研究的结果首次发现,MDV致瘤 株GA、RB IB感染的 cEF及自然MD肿瘤细胞中均有相当水平的meq基因产 物的表达。 3通过构建重组反转录病毒研究meq基因的功能 应用磷酸钙与MDv meq基因重组的反转录病毒转染栽体质粒RcAs-meq的 DNA,转染于鸡胚成纤维细胞系DFI。经间接免疫荧光技木研究表明,转染后第3 天即开始有少量DFI细胞在细胞核表达MEQ蛋白,以后阳性细胞增多,至转染后第 7天阳性细胞最多,之后荧光即衰减;通过酶联免疫吸附试验(E LJsA)检测,发现细 胞培养上清中游离病毒在转染后第5天即可检出,直至第7天仍堆持最高水平,第9 天开始下降;用细胞培养上清感染DFI细胞单层,于感染后第2天即可检出MEQ 蛋白阳性细胞,之后阳性细胞逐渐增多,到第4一5天达高峰,之后逐渐衰减;培养上 韦平.马立克氏病病毒meq基因功能的研究 清中的游离病毒在感染后第4天即可被检出,第5一7天达最高值。 利用重组反转录病毒(RCAs-meq)感染鸡胚成纤维细胞(CEF),使源于MDV 强毒参考株(VMDV)GA的meq基因表达于宿主细胞内,然后再用GA株感染CEF。 通过利用MDV强毒株特异的抗38kD磷蛋白(PP了8)单克隆抗体H19所进行的“黑 斑”试验以确定MDV的增殖水平,并与未接种重组反转录病毒RCAS-meq的CEF 进行比较。研究结果发现,细胞内表达的meq基因产物可促进GA株于体外培养细 胞中的感染与增殖,导致MDV的病毒斑数显著增多。 根据上述的研究结果,证实: 首次确定MEQ蛋白的分子量为60kD左右;强毒株与弱毒株之间在meq基因的 序列上存在两处有意义的特征性的差别;MEQ蛋白在MDv的宿主细胞系、非宿主 细胞系以及自然MD肿瘤细胞中的表达均定位在细胞核内,而且在致瘤株中的表达量 远远高于非致瘤株的:细胞内表达的meq基因产物可明显促进MDv GA株对体外培 养细胞的感染及增殖。这些都符合转录激活因子的特征。 因此,我们认为meq基因在感染细胞内的表达水平是
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S852.65

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