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《扬州大学》 2002年
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马立克氏病病毒meq基因功能的研究

韦平  
【摘要】: 马立克氏病病毒(Marek's Disease Virus,MDV)之众多已得到鉴定的基因中,目前有3个基因即132-bpr、pp38、meq可能与致瘤相关。其中,meq与132-bpr两个基因是MDV-1所特有,已证实132-bpr的拷贝数与毒株的体外致弱程度有关,pp38则被证实可抑制机体的免疫应答。meq基因由于具有与致瘤基因jun/fos家族类似的分子结构,因此,我们有理由认为meq基因在MDV致病、致瘤中可能发挥重要的作用。 本研究通过三个方面进行了研究,取得了如下主要实验结果: 1 MDV不同致病型(pathotypes)毒株meq基因序列的比较研究 应用PCR技术扩增了不同致病型MDVs,即国际通用Ⅰ型疫苗毒CV1988/Rispens株和中国特有的疫苗毒814株、特超强毒648A株(vv+MDV)以及6个广西分离到的野毒株共9个毒株的meq基因,进行核苷酸序列的测定并与标准强毒GA株(vMDV)进行核苷酸和氨基酸序列的比较。结果发现,MDV不同致病型的meq基因序列相对比较保守,它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高;但是,与所有七个致瘤性的MDV毒株相比,二个Ⅰ型弱毒疫苗CV1988/Rispens株和814株均出现了两个特征性的突变:即第194位的P缺失性突变和第71位氨基酸由A变成了S的位点突变;缺失性突变恰恰位于meq基因中转录激活域内的一个多脯氨酸的重复序列(PPPP)之中。此外,研究还发现了meq基因的两类有趣的重复结构,其中一类是含15个氨基酸残基(EELCAQLCSTPPPPI)的结构,有2个重复,另一类是含6个氨基酸残基(PPICTP)的结构,共有4个重复,它们全部分布在MEQ蛋白C-端的转录激活域内。 2 meq基因产物的鉴定及其细胞内表达特征的研究 源于MDV GA株的meq基因被克隆到杆状病毒转移载体质粒pBluBac4中强有力的多角体蛋白启动子(P_(PH))之后,经与线性化的Bac-N-Blue DNA共转 扬州大学博士学位论文三 染于昆虫细胞系SFg,获得了重组杆状病毒。应用重组痘病毒表达的MEQ制 备的单抗23B46对重组杆状病毒感染的SFg细胞及其裂解物分别进行间接免疫 荧光试验、Westem Blot和免疫沉淀试验的检测。结果发现:本表达系统产生 的MEQ蛋白可被重组痘病毒表达的MEQ制备的单抗23B46所识别;在感染 细胞中,MEQ蛋白仅局限于细胞核内,而且随着感染后(PI)时间的增加,具有 从核质向核仁和核膜转移的趋向;W已stem Blot和免疫沉淀试验均证实重组杆 状病毒感染细胞裂解物中出现有两条大小约为60 kD的特异带。实验的结果证 明杆状病毒/昆虫细胞系统用于表达外源基因可行有效。 利用通过杆状病毒载体在昆虫细胞系SFg上高度表达的MEQ蛋白产物免 疫BALB/c小鼠,然后收获其免疫脾细胞并与肿瘤细胞系SPZ/0通过PEG于体 外融合;获得的杂交瘤细胞被克隆并通过与MDV感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)做免疫荧光试验(FA),进行其分泌抗MEQ单克隆抗体(McAb)能 力的筛选。获得4株稳定产生抗MEQ蛋白McAb的杂交瘤细胞,其中3G12E6 单抗通过FA和免疫酶组化技术能够检测到MDV致瘤株感染的CEF及自然 MD肿瘤细胞中表达的me叮基因产物,而在非致瘤株CVI988/Rispens感染的 CEF和免疫的正常鸡的组织中则未检测到。研究的结果首次发现,MDV致瘤 株GA、RB IB感染的 cEF及自然MD肿瘤细胞中均有相当水平的meq基因产 物的表达。 3通过构建重组反转录病毒研究meq基因的功能 应用磷酸钙与MDv meq基因重组的反转录病毒转染栽体质粒RcAs-meq的 DNA,转染于鸡胚成纤维细胞系DFI。经间接免疫荧光技木研究表明,转染后第3 天即开始有少量DFI细胞在细胞核表达MEQ蛋白,以后阳性细胞增多,至转染后第 7天阳性细胞最多,之后荧光即衰减;通过酶联免疫吸附试验(E LJsA)检测,发现细 胞培养上清中游离病毒在转染后第5天即可检出,直至第7天仍堆持最高水平,第9 天开始下降;用细胞培养上清感染DFI细胞单层,于感染后第2天即可检出MEQ 蛋白阳性细胞,之后阳性细胞逐渐增多,到第4一5天达高峰,之后逐渐衰减;培养上 韦平.马立克氏病病毒meq基因功能的研究 清中的游离病毒在感染后第4天即可被检出,第5一7天达最高值。 利用重组反转录病毒(RCAs-meq)感染鸡胚成纤维细胞(CEF),使源于MDV 强毒参考株(VMDV)GA的meq基因表达于宿主细胞内,然后再用GA株感染CEF。 通过利用MDV强毒株特异的抗38kD磷蛋白(PP了8)单克隆抗体H19所进行的“黑 斑”试验以确定MDV的增殖水平,并与未接种重组反转录病毒RCAS-meq的CEF 进行比较。研究结果发现,细胞内表达的meq基因产物可促进GA株于体外培养细 胞中的感染与增殖,导致MDV的病毒斑数显著增多。 根据上述的研究结果,证实: 首次确定MEQ蛋白的分子量为60kD左右;强毒株与弱毒株之间在meq基因的 序列上存在两处有意义的特征性的差别;MEQ蛋白在MDv的宿主细胞系、非宿主 细胞系以及自然MD肿瘤细胞中的表达均定位在细胞核内,而且在致瘤株中的表达量 远远高于非致瘤株的:细胞内表达的meq基因产物可明显促进MDv GA株对体外培 养细胞的感染及增殖。这些都符合转录激活因子的特征。 因此,我们认为meq基因在感染细胞内的表达水平是
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 许娜娜;三株鸡马立克氏病毒流行强毒株基因组重复区序列测定及分析[D];吉林农业大学;2011年
2 宋翠萍;抗马立克氏病病毒VP22蛋白单克隆抗体的研制及应用[D];扬州大学;2006年
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前6条
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3 阳秀英;韦平;黄志永;磨美兰;韦天超;李康然;韦住奉;赖家宏;朱学勤;;我国部分省区鸡传染性法氏囊病病毒的分子流行病学研究[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
4 张洪海;刘青;邱波;刘功振;成子强;;地方柴鸡中J亚群禽白血病与马立克氏病的混合感染[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会鸡淋巴白血病防控技术研讨会论文集[C];2010年
5 徐守振;尹燕博;郭艳艳;;山东胶东地区规模鸡场三种主要病毒感染情况的调查[A];中国畜牧兽医学会食品卫生学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2010年
6 陈翠英;谢青梅;李红梅;尚辉琴;薛春宜;陈峰;舒鼎铭;曹永长;毕英佐;;马立克病病毒诱导的鸡肝脏组织中基因表达谱的分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵冬敏;B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性[D];山东农业大学;2010年
2 吴异健;两种中药多糖对呼肠孤病毒感染番鸭的免疫调节作用[D];福建农林大学;2010年
3 孙亚妮;免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用[D];山东农业大学;2011年
4 邱玉玉;A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备和不同亚群禽白血病病毒共感染相互影响的研究[D];山东农业大学;2011年
5 徐世文;三氧化二砷抗鸡MD肿瘤效应及其机理的研究[D];东北农业大学;2001年
6 郑世民;雏鸡感染鸡传染性贫血病毒后免疫变化和对新城疫疫苗的应答及其免疫机理[D];东北农业大学;2002年
7 姜世金;Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的表达及序列测定与分析[D];中国农业大学;2003年
8 张志;我国近年来马立克氏病病毒野毒株分子流行病学和生物学特性的研究[D];山东农业大学;2004年
9 刘思当;鸡J亚群白血病病毒与网状内皮增殖病病毒混合感染发病机理的研究[D];中国农业大学;2005年
10 丁家波;马立克氏病病毒pp38基因及其上游双向启动子的生物学特性[D];山东农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李爽;鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D];华中农业大学;2010年
2 颜赟;鸡免疫抑制性病毒共感染的流行病学调查[D];山东农业大学;2010年
3 刘功振;禽白血病病毒J亚群、B亚群的分离鉴定及核酸探针的制备[D];山东农业大学;2010年
4 孟斌;山东省白羽肉鸡免疫抑制病病原学和血清学调查[D];山东农业大学;2010年
5 吴萍萍;四种蛋传性病毒病多重PCR检测方法的建立[D];安徽农业大学;2010年
6 唐茂恒;烟台地区规模化肉种鸡场免疫抑制性疫病的流行病学调查[D];山东农业大学;2010年
7 王鑫;不同来源纤维肉瘤的鉴别诊断及人工致病试验[D];山东农业大学;2011年
8 张振杰;皖南黄肉种鸡ALV-J与REV的共感染及其分子变异分析[D];山东农业大学;2011年
9 王峰;J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒单克隆抗体的研制[D];山东农业大学;2011年
10 杨凤;山东地区禽白血病发病鸡群的流行病学调查及致病特性的研究[D];山东农业大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨茂,陶佩珍;单纯疱疹病毒Ⅰ型基因表达调控研究的进展[J];病毒学报;1997年04期
2 方忠意,崔保安;脊椎动物病毒分类的新近变化[J];动物医学进展;2005年06期
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5 陈鸿军;宋翠萍;秦爱建;张晨飞;;MDV-1CVI988/Rispens疫苗毒体外感染期间VP22的表达及细胞间转导作用[J];中国科学C辑:生命科学;2006年02期
6 陈志琳,崔治中,秦爱建,韩凌霞,吉荣,刘岳龙,金文杰;表达马立克氏病病毒gI基因的重组鸡痘病毒的构建[J];扬州大学学报;2002年01期
7 陈志琳,崔治中,秦爱建,张志,吉荣,刘岳龙,金文杰;表达马立克氏病病毒gI基因重组鸡痘病毒的免疫原性[J];扬州大学学报;2002年02期
8 陈鸿军,秦爱建,丁铲,苗晋锋,张鑫宇,何秀苗,金文杰,刘岳龙;MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析[J];扬州大学学报;2003年04期
9 费东亮,杜绍范;禽流感检测方法研究进展[J];现代畜牧兽医;2005年08期
10 姜永萍,张洪波,李呈军,步志高,张芳芳,于康震,陈化兰;密码子的鸡体偏嗜性优化增强H5亚型禽流感HA基因的表达水平和免疫原性[J];免疫学杂志;2005年05期
中国博士学位论文全文数据库 前9条
1 秦爱建;禽白血病病毒J亚群囊膜糖蛋白基因的生物学和生物化学特性[D];扬州大学;1999年
2 刘岳龙;鸡贫血病毒中国株基因序列比较、病毒编码蛋白的表达及分子克隆化病毒的构建[D];扬州大学;2001年
3 韩凌霞;马立克氏病病毒gB、gI、pp38基因的原核系统表达及其特异性单抗的研制和初步应用[D];扬州大学;2001年
4 姜世金;Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的表达及序列测定与分析[D];中国农业大学;2003年
5 杨峰山;抗Bt小菜蛾的选育、受体基因克隆及PTD对Cry1Ac的增效作用[D];中国农业大学;2004年
6 张志;我国近年来马立克氏病病毒野毒株分子流行病学和生物学特性的研究[D];山东农业大学;2004年
7 肖少波;伪狂犬病毒gC基因“自杀性”DNA疫苗及VP22蛋白转导的免疫增强效应研究[D];华中农业大学;2004年
8 丁家波;马立克氏病病毒pp38基因及其上游双向启动子的生物学特性[D];山东农业大学;2005年
9 付本懂;人参皂苷抗马立克氏病肿瘤形成作用及其机制研究[D];吉林大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前5条
1 丁家波;马立克氏病病毒囊膜糖蛋白gI基因的分子生物学特性[D];扬州大学;2001年
2 陈任安;PTD-bcr/abl融合蛋白的表达及其对K562细胞生长的影响[D];第四军医大学;2002年
3 刘强;PTD介导BCR/ABL蛋白细胞转导及免疫原性的研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
4 丁劲;TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶的表达纯化及其抗病毒活性的初步研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
5 张颖;鸡马立克氏病病毒TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D];内蒙古农业大学;2006年
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 吴俊铭;叶喜永;李强;;禽用基因工程疫苗的研究和应用进展[J];畜牧兽医科技信息;2010年10期
2 龚振华;胡国明;蒋文明;刘朔;李蕾;王永玲;王素春;陈继明;;我国马立克氏病研究进展[J];中国动物检疫;2012年07期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 薛乐全;抗生素和室温存放时间对马立克疫苗蚀斑计数及免疫效果影响的研究[D];山东农业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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5 韦平,Lucy F Lee;马立克氏病病毒MEQ蛋白对MDV增殖影响的研究[J];广西农业生物科学;2002年01期
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【相似文献】
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8 李桂芬;新病理型马立克氏病病毒的特性[J];畜牧兽医科技信息;1998年20期
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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7 高巍;秦爱建;宋红芹;王小波;吴力力;;不同马立克氏病病毒毒株的vIL8表达水平分析[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年
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6 王道坤;几类兽用新疫苗[N];山东科技报;2007年
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10 翎羽;影响疫苗效果的因素[N];农民日报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
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3 李延鹏;马立克氏病病毒meq基因缺失株生物学特性及其免疫效果研究[D];中国农业科学院;2010年
4 徐明;马立克氏病病毒诱导的免疫应答基因表达谱及miRNA对肿瘤发生的调节作用[D];吉林大学;2011年
5 张雪莲;表达血清1、3型马立克氏病病毒gB主要抗原表位的重组CVI988病毒构建及其免疫保护作用[D];南京农业大学;2003年
6 李永清;禽流感病毒M2基因克隆、表达及其重组马立克氏病病毒的构建[D];中国农业大学;2004年
7 陈志琳;表达马立克氏病病毒gl基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用[D];扬州大学;2002年
8 韩凌霞;马立克氏病病毒gB、gI、pp38基因的原核系统表达及其特异性单抗的研制和初步应用[D];扬州大学;2001年
9 丁家波;马立克氏病病毒pp38基因及其上游双向启动子的生物学特性[D];山东农业大学;2005年
10 邹亚学;5’调控序列的甲基化水平及siRNA对端粒酶活性的影响[D];吉林大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 周祥;广西马立克氏病病毒野毒株的分离与鉴定及其与其它病毒共感染的研究[D];广西大学;2007年
2 张颖;鸡马立克氏病病毒TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D];内蒙古农业大学;2006年
3 施维松;MDV部分流行株致病基因分析及疫苗免疫保护评价[D];东北农业大学;2008年
4 李余慰;马立克氏病病毒CVI988株pp24基因的克隆,表达及其部分生物学活性的研究[D];扬州大学;2002年
5 侯广玉;马立克氏病病毒致弱毒株的培育及其特性分析[D];黑龙江八一农垦大学;2010年
6 苏春霞;含NDV F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的构建及表达[D];西北农林科技大学;2004年
7 乔丽平;鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病病毒后3号染色体微卫星不稳定性的研究[D];南京农业大学;2007年
8 李继松;鸡马立克氏病病毒超强毒L-ZY株细菌人工染色体的构建[D];中国农业科学院;2009年
9 魏雪涛;含有MDVgB和IL-2重组火鸡疱疹病毒的构建及其免疫保护作用[D];南京农业大学;2005年
10 孙莹;鸡三种不同细胞中端粒酶基因和c-myc基因表达水平的研究[D];吉林大学;2007年
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