收藏本站
《扬州大学》 2002年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其免疫生物学特性

王芳  
【摘要】: 近年来,减毒细菌活载体因其能够刺激机体产生针对活载体及其携带的外源抗原的体液、细胞免疫和局部粘膜免疫受到人们的广泛关注,特别是近期研究结果证明许多活细菌载体能够作为DNA疫苗的运送载体,可以通过口服减毒细菌进入机体,从而诱导产生针对特定抗原的各种免疫应答。但迄今为止对活疫苗载体与宿主免疫系统间相互作用规律及其调控机制知之甚少,这方面的免疫生物学研究对于研制新型基因工程疫苗将会提供重要的理论依据,且对相关疾病的免疫防制有着重要的指导价值。因此我们构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的减毒鼠伤寒沙门氏菌,阐明其在体内、外感染试验的动态分布及它与抗原呈递细胞的相互作用规律,这为沙门氏菌疫苗载体及相关基因工程疫苗的研究奠定了理论基础。 1 表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定 应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550(pYAGFP)。用EcoRI和NcoI将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下,克隆进表达载体质粒pYA3334的EcoRI和NcoI位点之间,构建成重组表达质粒pYAGFP,然后依次转化大肠杆菌X6212、中间宿主X3730、终末宿主X4550。X4550于LB培养基上呈绿色,在荧光显微镜下观察,细菌整个菌体发绿色荧光。在体外稳定性试实验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后,单个菌落和菌液均呈绿色,证明构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS-PAGE结果显示,鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为27kD,这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB/c小鼠后,观察一个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型,为研究重组沙门氏菌免疫生物学特性研究提供了一个有力的工具,同时在相关疾病的免疫防制基础研究中也有重要应用价值。 扬州大学博士论文 2重组减毒鼠伤寒沙门氏菌感染动力学 用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550(pYAGFP)通过尾 静脉接种BALB/。小鼠,在不同时间,无菌取同一小鼠的肝脏、脾脏两种组织,经剪切、 研磨、稀释后涂布于LB平板,培养后计数。同时眼部采血,制备血清,以X4550(pYAGFP) 包被酶标板,用间接ELISA法测血清中抗细菌的抗体,结果表明,重组菌在这两个脏 器中的数量有两个时间高峰,总的趋势是越来越少,静脉注射后约41天仍能从肝脏脾 脏中分离到重组菌,这对携带外源抗原的载体激发机体产生足够的免疫应答十分有利; 而血清中抗体,随时间的推移,效价越来越高,说明经静脉注射途径,可以产生较高 的抗载体菌的体液免疫应答。在静脉注射后11一13天细菌数量达到一个高峰,刺激机体 产生应答,使抗体滴度逐渐升高,而此时细菌数量由于被抗体中和,呈下降趋势,至 17天时降至谷底,此时抗体滴度呈平缓上升阶段。随后细菌数量逐渐增多,刺激抗体 滴度迅速升高,抗体效价于21天时达到一个高峰,至23天时细菌数量达到第二峰值, 抗体效价开始下降,然后又逐渐上升,此时细菌数量一直在下降,而抗体效价一直在 上升。因此可以初步推断,细菌数量与血清中抗细菌的抗体呈一定的相关性。 另用相同的细菌口服接种BALB/c小鼠,在不同的时间,分别无菌取肝脏、脾脏、 肠系膜淋巴结和小肠派伊尔结(Peyer’5 patches,PPs),经剪切、研磨后全部涂布 于LB固体培养基上以计数,同时眼部采血以制备血清,以x4550(pYA3334)、x4550 (PYAGFP)和初步纯化的GPP包被酶标板,用间接EL工SA法测血清中抗细菌的抗体, 结果表明,随时间的推移,重组菌数量呈现正态分布的变化趋势,即开始和末尾数量 少,中间数量多。口服后,各脏器细菌约于10一巧天呈现最高峰值,在此过程中抗体 效价在逐渐上升,约到加天时抗体效价达到最高值,然后细菌数量的迅速递减至清除, 而抗体效价呈缓慢下降趋势。说明在机体免疫系统的作用下,细菌会被逐渐清除于体 外。有趣的是,口服途径的PPs细菌数量与血清中抗细菌的抗体呈一定的相关性,而 脾脏、肝脏及肠系膜中细菌数量与血清中抗细菌的抗体滴度无关,这些结果为载体菌 构建与应用提供了必要的认识。 3重组减毒鼠伤寒沙门氏菌与抗原呈递细胞的相互作用 为了明晰减毒鼠伤寒沙门氏菌与抗原呈递细胞间的相互作用,首先在体外用表达绿 色荧光蛋白的鼠伤寒沙门氏菌X4550(pYAGFP)感染巨噬细胞系、树突细胞系以及腹腔 巨噬细胞,在感染后2、4、6、9、12、24小时,用荧光显微镜观察感染情况,发现巨 噬细胞具有很强的吞噬能力,随着时间的延长,大部分细胞被感染,而且细菌逐渐在细 王芳:表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其免疫生物学特性 胞内分裂繁殖;而树突细胞系吞噬细菌的能力有限,仅有一部分细胞感染了细菌,随时 间推移,细胞感染数量变化不大,而腹腔巨噬细胞的吞噬能力比巨噬细胞系还要强,这 与巨噬细胞是主要吞噬细胞的性质一致。将感染细胞作透射电镜观察,结果显示,巨噬 细胞较活跃,有许多伪足,细胞器发达
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S852.4

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈平;胡涛;薛敬礼;杜春燕;章金涛;朱奎成;金树兴;王纯耀;;利用慢病毒载体快速建立表达外源基因的哺乳动物细胞系[J];生物技术通报;2011年07期
2 邓远洪;李能章;林立鹏;潘国庆;李田;周泽扬;;家蚕微孢子虫细胞分裂周期蛋白N端编码序列在酿酒酵母中的启动子活性分析[J];蚕业科学;2011年04期
3 高博;范志强;韩乃君;张念;张锦霞;王颖;白安斌;黄红梅;扈荣良;吴健敏;;Tn5转座子介导表达猪瘟E2蛋白和EGFP重组伪狂犬病毒的构建[J];中国动物传染病学报;2011年03期
4 李二峰;王殿东;杨宇红;谢丙炎;;根癌农杆菌介导甘蓝枯萎病菌的遗传转化[J];中国蔬菜;2011年14期
5 董浩;王莹;;PEDV COE基因重组乳酸菌在小鼠体内定植规律研究[J];中国兽药杂志;2011年07期
6 王帅;赵学明;朱化彬;杜卫华;郝海生;王栋;刘岩;秦彤;王宗礼;;pEGFP-loxP-Lox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化[J];农业生物技术学报;2011年04期
7 相兴伟;杨锐;陈琳;胡小龙;于少芳;吴小锋;;家蚕BmNPV多角体蛋白与外源蛋白共包埋入多角体的研究[J];病毒学报;2011年04期
8 林帆;刘清华;李军;隋娟;肖志忠;徐世宏;马道远;肖永双;;真鲷(Pagrus major)vasa基因5′端启动子克隆及表达载体构建[J];海洋与湖沼;2011年02期
9 刘丹;蔡高磊;张立;王建锋;康振生;韩德俊;;农杆菌介导短柄草遗传转化体系的建立[J];麦类作物学报;2011年04期
10 邓继贤;杨秀荣;韦英明;蒋和生;;沼泽型水牛卵泡抑素基因的真核表达研究[J];中国畜牧兽医;2011年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 兰丽珍;弓军胜;杨静;;加强型绿色荧光蛋白和C肽双基因在内皮细胞共转染的表达[A];2006年中华医学会糖尿病分会第十次全国糖尿病学术会议论文集[C];2006年
2 李扬;宋长城;罗松;宋小元;齐建国;王永潮;;IDl对细胞增殖、分化和调亡的影响[A];中国动物学会全国显微与亚显微形态科学分会第十次形态科学与显微注射技术学术研讨会论文摘要集[C];2000年
3 张雪莲;范伟兴;钱莺娟;陈德胜;陈溥言;;表达绿色荧光蛋白的马立克氏病病毒CVI988/Rispens株重组病毒的构建[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
4 戴利成;姚行;陆永良;闵丽姗;赵宁;钱福初;徐荻勇;许正平;;中期因子在肿瘤细胞中的核定位及其定位信号研究[A];中国细胞生物学学会医学细胞生物学学术大会论文集[C];2006年
5 刘肖飞;梁卫红;;G15V和T20N点突变对水稻OsRacD胞内定位和蛋白互作特性的影响[A];中国遗传学会植物遗传和基因组学专业委员会2009年学术研讨会论文摘要汇编[C];2009年
6 梁睿;罗庆;金先庆;;快速直视筛选结缔组织生长因子特异RNA干扰序列的研究[A];第八届全国儿童肿瘤学术会议论文汇编[C];2009年
7 田涛;王琦;梅汝鸿;;芽孢杆菌绿色荧光蛋白标记系统的建立[A];中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C];2004年
8 麻彤辉;杨红;冯学超;李永明;姜勇;徐丽娜;朱娜;;卤素敏感型绿色荧光蛋白在细胞膜水通道和氯离子通道研究中的应用[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
9 垢敬;;Exendin-4与绿色荧光蛋白融合基因的表达与活性研究[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年
10 李朝军;吕品;蒲咏;张东才;;利用绿色荧光蛋白基因标记技术研究钙调蛋白在HeLa细胞胞质分裂时的动态分布[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;化学诺奖得主为什么是钱永健[N];江苏科技报;2008年
2 ;“绿色荧光蛋白”能追踪癌细胞[N];江苏科技报;2008年
3 ;生物光的真谛:绿色荧光蛋白[N];大众科技报;2008年
4 李岿然 尹志 李丽云;绿色荧光蛋白“转基因”猪问世[N];江苏农业科技报;2007年
5 李岿然 尹志 记者 李丽云;国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪问世[N];科技日报;2006年
6 记者 朱伟光 特约记者 朱伟华 通讯员 鞠长荣 岳金凤;哈医大四院推出绿色荧光蛋白活体成像系统[N];光明日报;2006年
7 陈清华;从“绿色荧光蛋白”所想到的[N];中国财经报;2008年
8 王丰丰;华裔科学家钱永健摘诺贝尔化学奖[N];新华每日电讯;2008年
9 卜晓明;钱永健的终极挑战:攻克癌症[N];新华每日电讯;2008年
10 朱伟光;首例“转基因”克隆猪在哈降生[N];光明日报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王芳;表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其免疫生物学特性[D];扬州大学;2002年
2 张敏;Ⅰ、CD133在人直结肠癌肿瘤细胞体外增殖和侵袭能力中的作用及机制 Ⅱ、外源绿色荧光蛋白表达对肿瘤细胞体外生物学行为的影响[D];北京协和医学院;2012年
3 安志兴;绿色荧光蛋白融合基因在小鼠早期胚胎表达的研究[D];西北农林科技大学;2003年
4 徐越驰;组氨酸为活性中心的蛋白质酪氨酸磷酸酶和细胞自噬标记物的研究[D];吉林大学;2010年
5 李梅君;葡萄果实中脱落酸激活的钙依赖蛋白激酶:纯化、测序及定位[D];中国农业大学;2005年
6 卢永忠;钝顶节旋藻cpcB基因上游序列结构功能的研究[D];中国海洋大学;2005年
7 郑月茂;转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育[D];西北农林科技大学;2005年
8 魏映辉;双色荧光RNAi技术平台的建立和抗SARS-CoV RNAi的研究[D];吉林大学;2005年
9 关勇;基因增强组织工程化尿道的实验研究[D];天津医科大学;2006年
10 闫歌;RNA干扰沉寂survivin表达及其对肝癌细胞凋亡和相关信号传导通路的影响[D];重庆医科大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王俊杰;糖皮质激素诱导绿色荧光蛋白(GFP)在烟草中的表达[D];东北师范大学;2005年
2 张祖维;犬2型腺病毒活载体构建的基础研究[D];山西农业大学;2004年
3 宋志秀;家蚕核型多角体病毒FGF 的细胞和组织定位研究[D];江苏大学;2005年
4 李静;骨髓间充质干细胞在肾小管间质纤维化大鼠模型中肾脏分布的研究[D];四川大学;2005年
5 卢胜娟;骨骼肌特异性报告基因逆转录病毒载体的构建与验证[D];西华大学;2007年
6 尹彪;组蛋白乙酰转移酶修饰型人源载体的构建及其功能研究[D];中南大学;2007年
7 宋晓娟;囊泡法转染重组FSH在巴斯德毕赤酵母中的表达[D];扬州大学;2009年
8 李振林;视蛋白基因启动子—绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立[D];第一军医大学;2002年
9 武文;Bcr基因绿色荧光蛋白表达载体的构建及对K562细胞的影响[D];第一军医大学;2004年
10 左国伟;人乳头瘤病毒11型E6基因的克隆、真核表达及其功能的初步研究[D];重庆医科大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026