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《扬州大学》 2002年
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表达马立克氏病病毒gl基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用

陈志琳  
【摘要】: 30年来抗马立克氏病(MD)疫苗有了很大的发展,抗MD疫苗有下列几种:①单价疫苗,包括血清Ⅲ(HVT),血清Ⅱ型(SB-1)及致弱的血清Ⅰ型(CV1988)MDV疫苗。②多价苗,包括二价苗(血清Ⅰ型+血清Ⅱ型,血清Ⅰ型+血清Ⅲ型和血清Ⅱ型+血清Ⅲ型)及三价苗。伴随着抗MD疫苗的发展,马立克氏病病毒(MDV)本身也在不断突变、演化,毒力不断增强,常规的单价苗、多价苗已难以控制毒力不断增强的MDV,在过去的10年中,科学家们通过对MDV分子生物学的研究,力图研制出比现在常规疫苗效果更好、使用更方便的抗MD基因工程疫苗。MDV分子生物学的研究进展,MDV全基因组测序工作的完成,及MDV一些重要基因的鉴定、定位及结构与功能方面的研究成果,促进了马立克氏病基因工程疫苗的研制和开发。MDVgB糖蛋白是MDV主要保护性抗原,rFPV-gB及rHVT-gB已显示良好的保护性免疫,但仅一个靶抗原,其免疫保护性仍然有局限性,因此人们也在寻找除gB之外,其他与保护性有关的抗原成分作为基因工程目的基因,对疱疹病毒囊膜糖蛋白的研究发现,gD、gB、gI、gC、gE和gG具有免疫保护作用,而把多个靶抗原联合使用时,具有协同免疫保护作用。糖蛋白gI是疱疹病毒中重要的囊膜糖蛋白,它可与其他囊膜糖蛋白组成双价或多价疫苗,提高单一囊膜糖蛋白的免疫保护效力。此外,有研究报告表明gI的同源编码产物在细胞间传播、毒力介导、FC受体活性等方面都起一定的作用。以MDVgI作为靶抗原,开展保护性免疫研究,国内外未见报道。本研究以MDV gI为研究对象,以鸡痘病毒(FPV)中国株为载体,构建表达MDV gI基因的重组鸡痘病毒(rFPV),在构建成功表达MDV gI的rFPV的基础上,进一步分析rFPV-gI 扬州大学博士学位论文 的稳定性及鸡对rFPv一gI的抗体反应性,然后研究它的免疫保护效力,为研制 rFPV一MDv一gl基因工程疫苗,进一步开发多价MDV基因工程重组疫苗奠定基础。 根据MDV 648A株病毒基因组gl基因序列,我们设计了两个引物,用PCR 扩增出MDVgl基因。通过琼脂糖凝胶电泳,获得一条1 060 bp DNA条带,与 MDvgl基因的大小是一致。在此基础上,用Qiagen公司胶回收试剂盒来纯化 PCR产物。用Smal及Xhol来酶切PCR产物。用Smal和Sall酶切鸡痘病毒转 移质粒载体pFGI 175一1。连接,转化大肠杆菌DHS。,转化菌经筛选后,得到一 个含gl基因的阳性克隆,进一步纯化此阳性克隆DNA。用全自动测序仪测定插 入片段DNA序列,证明插入片段DNA序列与MDv·648A一gI序列完全一致。此 含MDVgi基因的重组转移质粒命名为pFGgill75一1。通过脂质体方法,将 pFGglll75一1转染已感染FPv野毒(wt)的鸡胚成纤维细胞(cEF),孵育3天后, 通过蓝斑筛选法,筛选纯化四次后得到纯化的:FPv,用PCR扩增rFPV DNA, 证实此rFpV含MDV 91基因。用FPv(wt)及rFPv感染96孔板上CEF,用pBS 洗涤,丙酮固定,然后加抗gI单克隆抗体37℃孵育30分钟,PBS充分洗涤后, 与抗鼠IgG荧光标记抗体作用,结果显示,rFPv感染的cEF有很强的荧光,而 FPv(wt)感染的CEF没有荧光。说明MDvgl得到表达,此表达MDVgl基 因rFpV命名为rFpV一MDV 64891。 用rFpv一MDv64sgl感染eEF,传代20次后,此rFPv仍然能够在CEF上稳 定复制。用lo4PFurFPv一MDv64sgl及FPv(wt)分别接种l日龄sFP鸡,饲养 于带正压过滤空气隔离器中,接种前及接种后20天采血收集血清,用间接免疫荧 光法(IFA)分析血清与感染MDv的cEF反应情况。结果表明接种FPv一MDv648gl 后鸡血清中含有抗gI抗体。 用104或lo6PFurFPv一Mnv“591接种l日龄sPF鸡和蛋鸡,在接种后10 天后用MDV RBIB攻毒,隔离饲养60天,在此期间,解剖死亡鸡,检查记录MD 大体病变,饲养第60天扑杀存活鸡,统计记录MD大体病变。接种1了PFu rFPv 的伊莎蛋鸡的保护指数为22.97,rFPv一gl免疫接种组MDv发病率及死亡率低于 FPv(wt)接种组,但差异不显著。接种1护PFU rFPv的白来航蛋鸡的保护指数 为27.40,rFpV一91免疫接种组MDv发病率显著低于FPv(讯)接种组(P0.05), 陈志琳:表达马立克氏病病毒gl基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用 rFPv一gI免疫接种组MDv死亡率低于FPv(wt)接种组,但差异不显著。接种 100PFu的sPF鸡保护指数为23.53,rFPv一gI免疫接种组MDv发病率及死亡率均 显著低于FPV(wt)接种组(P0.05)。 此结果表明表达MDVgl基因的rFPv有一定程度的抗超强毒株免疫保护力。 本研究是国内外首次报导构建表达MDvgi基因重组FPv,首次证实rFPV一MDVgi 具有一定程度的抗超强毒株免疫保护力。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S852.4

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【参考文献】
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