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《扬州大学》 2003年
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兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的表达及其免疫原性初探

严维巍  
【摘要】: 兔出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease virus,RHDV)所致的兔的一种急性、高度传染性、高度致死性的疾病,以全身实质器官水肿、淤血及出血性变化为主要特征。根据RHDV的形态学、生物化学和分子生物学特性,国际病毒分类委员会最近将其归类于嵌杯样病毒科兔病毒属。该病毒为单股正义RNA病毒,基因组由7437个核苷酸组成,拥有两个开放阅读框架,分别编码多个蛋白,其中衣壳蛋白是RHDV的唯一结构蛋白,称为VP60,与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。目前广泛使用的RHDV疫苗为组织灭活苗,虽然其长期以来一直具有良好的免疫效果,但具有其自身所不可避免的种种缺点。由于兔出血症病毒在体外组织细胞的培养方法尚未建立,所以,近年来,人们对RHDV疫苗的研究便主要着眼于基因工程苗的研制,其既能起到免疫预防作用,又能很好地解决组织灭活苗所带来的生物安全性问题。基于此,本研究在对RHDV不同分离株的VP60基因同源性进行广泛比较的基础之上,分别以大肠杆菌、昆虫细胞和毕赤酵母表达系统表达了中国株RHDV VP60基因,研究其抗原性和免疫原性,以期探索一条制备RHDV新型疫苗的途径。 本研究首先应用RT—PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84株中成功扩增出预期大小为1.7kb的衣壳蛋白基因特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEM-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆pGEM-T-VP60,序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1740bp,共编码580个氨基酸,该序列已被Genebank收录,登录号为AF402614,该序列为 11 扬州大学博士论文 Genebank收录的第一株RHDV中国分离株完整VP6O序列,也是国内外最早克隆测 序的RHDV中国分离株VP6O序列,并且该毒株还是世界上最早分离的RHDV毒株。 与其它国家报道的多株RHDV序列进行比较发现,其相互间同源性高达98 .2%~ 99.0%,其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%一99.1%,并且都没有碱基的插 入和缺失,表明VP60是一个很保守的片段。该核酸序列与欧洲野兔综合征病毒 (European br0Wn hare syndrome virus,EBHSV)和无致病性的兔嵌杯样病毒 (Rabbit ealieivirus,RCV:)的核酸同源性则分别只有68.8%~70.5%和85.8%~ 86.5%之间,氨基酸同源性分别居74.5%~75.0%和90.6%~91.9%之间。 应用亚克隆技术将编码兔出血症病毒(RHDV)WX84株衣壳蛋白的VP60基因物 按相应的阅读框架克隆到表达性载体pGEX一6P一1中谷胧甘肤转移酶(GST)基因的下 游。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株,在1 .Olnmol/L IPTG浓度和37℃的条件 下诱导,GST一VP60基因融合蛋白获了高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的 20.52%。经聚丙烯酞胺凝胶电泳和Western一blot试验证实所表达的融合蛋白产物 分子量与预期的87K Dal相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小 鼠,所得抗血清应用间接El.工SA检测,与RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表 明,大肠杆菌中表达的RHDV VP6O融合蛋白保留着天然衣壳蛋白的部分抗原性。 但该表达产物与RHDV的天然高免血清反应强度较弱,提示着该表达产物在抗原性 上与天然RHDV的Vp6O蛋白还存在着一定的差异,这可能与其融合有一个29Kd的 谷胧甘肤(GST)有关。 为更好的研究重组VP印蛋白的的抗原性和免疫原性,利用亚克隆技术将RHDV 的VP6O基因克隆入另一广泛使用的原核表达载体—PETS中进行表达研究。该 载体仅融合有一个包括n个氨基酸的表达标签(T7*TAG),并且该表达标签经研究 发现对大多数动物的免疫原性都极弱。将重组质粒PET5a--VP6O转化入大肠杆菌 BL21(DE3)株,在0.4nunol/L IPTG浓度和37oC的条件下诱导3小时,VP60蛋白获 了高效表达,表达的目的蛋白在菌体总蛋白中含量超过17.14%。经聚丙烯酞胺凝 胶电泳和Western一blot试验证实所表达的蛋白产物分子量与预期的62K Dal相 符。并且,该重组蛋白在Western一blot中与兔抗RHDV高免血清呈强阳性反应,对 vP60两种融合蛋白的比较结果表明,融合蛋白中前导多肤的大小确实对被表达蛋 白诸如抗原性等的生物学活性具有较大地影响。 昆虫杆状病毒表达系统是一种良好的真核表达体系,以其忠实高效表达而广 严维巍:兔出血症病毒中国株衣壳蛋白墓因的表达及其免疫原性初探111 泛应用于外源基因的体外表达及结构与功能研究。本研究为了构建表达阳DV VP60 蛋白的重组杆状病毒,以心了H对含有RHDV VP60基因的重组克隆载体PG即一T- VP60进行单酶切,经琼脂糖凝胶电泳后回收R圣IDV VP60基因片断,并与抢了H单 酶切的杆状病毒转移载体PBLUEBAc4和PBLUEBACHISB连接,以氛化钙法转化大 肠杆菌TOP10F’株,获得T重组转移载体pBLUEBAC4一即60和pBLUEBACHISZB一 VP60。在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体曲LUEBAc4一vP60和 pBLUEBACH工SZB一vP6O与线性化的野生型杆状病毒DNA共转染对数生长期的Sfg昆 虫细胞,经过三轮蚀斑纯化后,获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUEBAC4一vP60和 PBLUEBAcHISZB一VP60。提取重组杆状病毒DN
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.4

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