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从重组毕赤氏酵母中制备腺苷甲硫氨酸的研究

蔡瑞  
【摘要】:S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是生物体的重要代谢中间物质,也是人体内一种重要的生理活性物质,可作为一种重要的药物。本实验室已经构建了强化表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组Pichia pastoris酵母,使其能强化积累SAM。在摇瓶发酵的基础上,本文探讨了中试发酵条件下,各重要发酵条件对其SAM产量的影响,建立了能高产SAM的中试发酵条件,并且研究摸索出了合适的分离SAM的下游工艺方法。 通过5-L工作体积发酵罐的发酵实验,研究了发酵中pH、溶解氧、加甘油和甲硫氨酸等条件对细胞生长和SAM积累的影响。结果表明:重组菌在pH5.0时生长比较旺盛,细胞生长进入稳定期后调节为pH6.0可以使重组Pichia pastoris继续积累SAM。溶解氧低时SAM积累高于溶解氧高时SAM积累。优化发酵初始甘油浓度为4%,并在发酵时流加甘油,有助于SAM的积累。前期加入一定量的甲硫氨酸,发酵中继续流加补充,最后产量达到了4.3g/L。 对发酵的菌体,采用了先用乙酸乙脂处理,后用酸处理的破胞方法,离心后得到上清。选用不同的树脂做静态吸附及洗脱实验,根据结果吸附及洗脱能力选用大孔弱酸性阳离子交换树脂D151。用此树脂装柱来吸附SAM,根据试验,确定了上清的上样量,上清的最适pH,上样的速度。采用分布洗脱的方法,先用水洗去杂质,然后用0.1mol/L的硫酸溶液洗脱得到含SAM的洗脱液。再经过离子交换树脂1×13.4脱盐、浓缩后、用正丁醇和乙酸乙脂的混合液沉淀SAM,最后得到了SAM产品,其纯度达91.0%,且不易吸潮。


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