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《扬州大学》 2004年
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共表达新城疫病毒融合蛋白基因和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

韦栋平  
【摘要】:新城疫是由副粘病毒科的新城疫病毒(Newcastle diseae virus,NDV)引起的一种烈性家禽传染病,它对我国养禽业的危害最为严重。低致病性H9亚型禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)是目前影响我国养禽业的主要AIV亚型,它对我国养禽业也已造成了严重的经济损失。当前我国对ND和H9亚型AI的控制主要应用常规疫苗的免疫接种。但是作为我国目前控制ND和H9亚型AI流行的重要手段,常规疫苗的免疫接种会干扰现有技术条件下的免疫监测和流行病学调查。而且油乳剂灭活疫苗使用后会引起严重应激,并且生产成本偏高等。为了研制一种可以克服上述缺点的新型载体联合疫苗,本研究用鸡痘病毒(Fowlpox viros,FPV)作为表达载体,构建了能够同时表达NDV融合蛋白(Fusion protein,F)基因和H9亚型AIV血凝素(Hemagglutinin,HA)基因的重组鸡痘病毒,并对其免疫效力进行了评估。 1.共表达NDV F基因和H9亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒的构建及其生物学特性鉴定 以酚-氯仿提纯NDV F48E8株的基因组RNA作为反转录聚合酶链反应(RT-PCR)模板,扩增出长度约为1.7Kb的NDV F基因片段,将其克隆入pGEM-Teasy载体,构建重组质粒pGEM-TF并进行测序确证;以质粒pUCHA为模板,用PCR扩增出约为1.7Kb的H9亚型AIV HA基因片段,将其克隆入pGEM-T easy载体,构建重组质粒pGEM-THA并进行测序确证。分别从pGEM-TF和pGEM-THA切下F基因和HA基因,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的FPV基因组复制非必需片段,并使分别调控F基因和HA基因转录的鸡痘病毒启动子P_(E/L)和合成启动子P_S以反向方式连接,重组质粒命名为p7SHF。最后将P11-LacZ报告基因表达盒插入到质粒p7SHF中,获得转移载体pFPVHF,用以转 扬州大学博士学位论文 染经预先感染FPV 282E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞(CEF).通过在含有X.Gal的 营养琼脂上挑选蓝色病毒蚀斑,经过多次蓝斑筛选和克隆纯化后,获得稳定生长 的重组鸡痘病毒(rFPv一F一HA)。PCR和Southem一blot检测证实了F基因和HA基 因已成功插入到FPV的基因组:间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正 确表达HA和F蛋白。 比较rFPv一F一HA和wt一FPv在CEF上的繁殖滴度,结果发现两者在CEF中的繁 殖滴度无显性著差异,提示载体病毒的复制能力并未因外源基因的插入而下降。 将rFPV一F一HA在CEF上连续传代培养20代次后,蓝色空斑试验和PCR检测结果表 明插入的F基因和HA基因均能够在病毒的传代过程中稳定遗传;间接免疫荧光试 验证实第20代次的重组鸡痘病毒仍然能够正确表达F和HA蛋白,进一步表明了 rFPv一F一HA具有良好的遗传稳定性。 2.NOV「蛋白抗体的间接ELISA检测方法的建立及评估 用经过充分灭活的NDV F48E8株作为包被抗原,建立了检测由FPV载体介 导表达的NDVF蛋白的抗体的间接ELJSA方法,并用动物试验进行了初步评估。 以方阵滴定法确定抗原的最佳包被浓度为355n留孔,待检血清最佳稀释度为1:40。 通过交叉试验、阻断试验和重复性试验证实所建立的间接ELisA方法具有高度的 特异性和良好的可重复性。用该间接EUSA方法测定了20份阳性血清样品的P加 值,并通过对该20份阳性血清的P/N值与ELisA抗体效价(ELISA titer, ET)的 自然对数值(InET)的线性回归分析,获得了回归方程1 nET=0 .201 XP/N+4 .632, 通过测定待检血清在l:40稀释度的P/N值,用方程直接求出血清的ELISA抗体滴 度,可以实现定量检测。应用该间接ELISA方法对表达NDVF基因的重组鸡痘病 毒免疫鸡群进行了血清抗体检测,结果表明,血清的间接ELISA抗体效价与中和 试验所测定相应血清的中和抗体效价高度相关(P0 .01)。攻毒保护试验结果显示, 间接ELISA抗体效价和机体保护力之间表现一定程度的相关性。该方法的建立为 后续试验评估表达NDVF基因的重组鸡痘病毒免疫鸡群的免疫效果提供了一种可 靠的血清学方法。 3.共表达NDVF基因和H9亚型AIVHA基因的重组鸡痘病毒的免疫效 力试验 3.1试验鸡接种rFPv一F一HA后抵抗H9亚型Alv感染的免疫保护作用 7日龄SPF雏鸡随机分为4组,分别于颈部皮下接种rFPv一F一HA(104PFU/羽)、 韦栋平:共表达NDVF基因和H9亚型AlvHA基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力iii rFPv一队(lo4PFu/羽)、wt一FPv(一o4PFu/羽)和Hg亚型Al油乳剂灭活疫苗(0.ZmL/ 羽)。免疫后7~21天,除wt一FPv外,各种疫苗均可诱生针对H9亚型Alv的特异 性HI抗体。其中以油乳剂灭活疫苗诱生的HI抗体效价最高,而rFPv一F一HA诱生 的Hl抗体效价与单表达队基因的rFPV一队诱生的HI抗体效价差异不显著。免疫 后21天,各组试验鸡用剂量为107ELDS丫羽的Hg亚型川vF株滴鼻攻毒,并于攻 毒后5天采集试验鸡的口腔棉拭子,按照常规方法处理后,接种10日龄SPF鸡胚 作病毒分离试验。结果显示各组试验鸡的口腔排毒率为:wt一FPV免疫组(100%)、 rFPV一F一HA免疫组(16.7%)、rFPV一队免疫组(16.7%)和油乳剂灭活疫苗免疫组 (16.7%)。 用含有残余抗NDV和H9亚型AIV母源抗体的26日龄商品蛋鸡进行免疫效力 试验,结果发现,尽管由于母源抗体的干扰,rFPV一F一HA及rFPV一HA在商品蛋鸡体 内诱生的HI抗体效价远低于?
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1 金宁一,司兴奎,顾万钧,郭志儒,罗坤石,毅殷震;鸡痘病毒282E_4株基因组末端非必需区的序列测定与分析[J];高技术通讯;1999年09期
2 何金箭;于丽玲;关有吉;杨素萍;金明兰;;一起鸡痘病毒与巴氏杆菌混合感染的诊治[J];养殖技术顾问;2008年04期
3 许青荣,王桂枝,杨爱梅,毕丁仁,赵雅心,杜松枝;鸡痘病毒的分离鉴定[J];中国预防兽医学报;2000年05期
4 孙明,刘东海, 金宁一,殷震;鸡痘病毒282E_4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析[J];中国兽医学报;1994年01期
5 马凤龙,金宁一,刘晓明,司兴奎,顾万钧,殷震;鸡痘病毒282E_4株Bam HI部分片段的重组载体质粒构建与序列分析[J];中国兽医学报;1999年03期
6 孙明琴;;鸡痘病毒细胞培养方法的探索[J];山东畜牧兽医;2007年05期
7 顾万钧,王淑敏;鸡痘病毒分子生物学研究进展[J];吉林农业大学学报;1995年01期
8 刘永明;;饲养肉鸡慎防鸡痘[J];新农业;2006年12期
9 何金箭;于丽玲;杨素萍;关有吉;金明兰;;一起鸡痘病毒与巴氏杆菌混合感染诊治[J];养殖技术顾问;2010年12期
10 顾万钧,金宁一,殷震;鸡痘病毒282E_4株TK基因重组载体质粒的构建[J];中国兽医学报;1996年03期
11 张勇敏;傅彩农;;鸡痘的预防与治疗[J];浙江畜牧兽医;2009年01期
12 徐泽仕;;用鸽痘痂预防鸡痘[J];养禽与禽病防治;1988年06期
13 肖履中;鸡痘病毒诱发细胞融合现象的观察[J];黑龙江畜牧兽医;2000年11期
14 丁淑岚;;屠宰检疫中鸡痘的鉴定与防治[J];新疆畜牧业;2010年05期
15 孙明,刘东海,金宁一,殷震;鸡痘病毒282E_4弱毒株TK基因的定位与克隆[J];中国兽医学报;1992年02期
16 姜洪文;姜瀛;冯泽;金仁哲;温健;王洪帅;;鸡痘病毒与巴氏杆菌混合感染[J];吉林畜牧兽医;2008年03期
17 杜永所;李晓明;;鸡痘的防治[J];养禽与禽病防治;2008年12期
18 张嘉栋;Bernie Beckman;;蛋鸡鸡痘的预防[J];中国禽业导刊;2010年13期
19 赵振芬;刘桂永;沈瑞忠;袁世山;;鸡胚不同接种途径及收取部位鸡痘病毒的含量比较[J];中国兽医杂志;1996年04期
20 司兴奎,金宁一,顾万钧,马凤龙,郭志儒,罗坤,石毅,殷震;鸡痘病毒282E4株Bam HIFa、Fb、Fc片段非必需区筛选与序列分析[J];中国兽医学报;1999年04期
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1 郭志儒;金宁一;方厚华;罗坤;金扩世;李萍;;鸡痘病毒282E4株表达载体构建及新城疫病毒F蛋白的表达[A];第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2001年
2 李臻;金宁一;金洪涛;郑敏;付延军;辛苏文;;新型鸡痘病毒重组转移载体的构建[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会第六届代表大会论文集[C];2006年
3 韩松;金宁一;李霄;;表达PRRSV GP5、M蛋白重组鸡痘病毒的构建与鉴定[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集[C];2008年
4 王刚;于颖;孙洪磊;刘思当;;整合禽网状内皮组织增生病病毒基因的鸡痘病毒对鸡致病性的病理学研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年
5 朱瑞良;牛钟相;王玉燕;崔治中;齐俊良;庄立业;梁克举;;新型鸡痘病原分离鉴定及其防治研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
6 朱战波;刘存霞;金明兰;计越;常巧呈;袭莹;鲁会军;金扩世;金宁一;;共表达NDV F和HN基因的重组鸡痘病毒rFPV-FHN构建及其遗传稳定性[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
7 马鸣潇;金宁一;刘慧娟;金明兰;郑敏;贾雷立;金扩世;;口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建[A];中国畜牧兽医学会2006学术年会论文集(上册)[C];2006年
8 钱莺娟;张雪莲;陈德胜;陈溥言;;不同方式表达马立克氏病病毒糖蛋白B重组鸡痘病毒转移质粒载体的构建[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
9 张万林;宋立芹;付秀花;王艳;;鸡痘、传染性喉气管炎二联活疫苗安全性和免疫效力试验[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2008)[C];2008年
10 贾雷立;金宁一;金扩世;鲁会军;郑敏;李昌;王瑞琳;连海;王浩然;尹荣兰;夏志平;陈义锋;金明兰;;高致病性AIV复合多表位重组鸡痘活载体疫苗的构建及表达研究[A];第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会论文集(下)[C];2005年
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1 房斗;怎样防治鸡痘[N];中国畜牧报;2005年
2 科协;怎样防治鸡痘[N];江苏科技报;2001年
3 施政;生物技术带来新一轮农业革命[N];农民日报;2002年
4 刘丽 冯艳风;如何防治鸡痘[N];中国畜牧报;2003年
5 华南农业大学 许家强;珍禽的饲养与疾病防治(5月2日)[N];广东科技报;2001年
6 宁夏多维泰瑞制药有限公司;禽呼吸道支原体病[N];中国畜牧报;2002年
7 李连任 徐志善;冬末春初谨防肉鸡毒霉浆体病[N];中国畜牧报;2003年
8 扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室 刘秀梵教授;在动物疫病控制中正确认识现代生物技术与常规技术的关系[N];中国畜牧报;2002年
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1 刘存霞;鸡痘病毒282E4株基因组和蛋白质组解析、载体构建与HIV重组疫苗研究[D];吉林大学;2013年
2 陈志琳;表达马立克氏病病毒gl基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用[D];扬州大学;2002年
3 邵卫星;分别表达鸡白细胞介素1β、白细胞介素2和骨髓单核细胞生长因子基因重组鸡痘病毒的构建及其对ND疫苗免疫效力的影响[D];扬州大学;2004年
4 马鸣潇;FMDV分子背景分析、病毒拯救及多价基因工程疫苗研究[D];吉林大学;2007年
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6 朱战波;表达NDV、IBDV及FMDV基因的重组FPV载体活疫苗构建和实验免疫研究[D];吉林大学;2012年
7 郭抗抗;猪瘟病毒的shRNA干扰、强弱毒鉴别及基因工程疫苗研究[D];西北农林科技大学;2010年
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1 刘文峰;一起鸡痘病毒继发葡萄球菌感染病例的诊断[D];吉林大学;2014年
2 周春红;鸡痘病毒高效表达载体的构建及应用[D];扬州大学;2001年
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5 周平;一株高致死性鸡痘病毒的全基因序列的测定及初步分析[D];吉林大学;2013年
6 于海;中草药及核糖体灭活蛋白抗病毒的试验研究[D];山东农业大学;2005年
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